复杂样品中6种磷脂的多重检测方法，包括HPLC分析：正相硅胶色谱柱，100mm×4.6mm，柱温25℃；洗脱流速1.5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为：0.0min，A40％，B57％，C3％；8.0min，A40％，B50％，C10％；15.0min，A40％，B50％，C10％；15.1min，A40％，B57％，B3％；24.0min，A40％，B57％，C3％；其中，流动相A是含0.01～0.08％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是10～20％的乙酸溶液。本发明专利技术的方法操作简单、快速准确、各组分分离良好、重复性高，易于检测实践中应用推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析领域，尤其是涉及复杂生物样品中多种磷脂组分的同时检 测。
技术介绍
动植物体内磷脂种类繁多，多以磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺为主。受限于生物样 品中复杂组分的干扰，磷脂组分的检测，尤其是磷脂组分的多重检测方法亟待开发。 现有技术中，磷脂分析常用的方法有薄层色谱法（TLC)、高效液相色谱（HPLC)、质 谱（MS)和气质联用（C-MS)技术等。随着质谱技术的发展，更为强大的LC-MS方法也用于 磷脂的定向定量分析中。检测实践中，高效液相色谱法（HPLC)仍然是目前磷脂分离和定性 定量分析的最常用的方法。HPLC分析磷脂常用检测器为紫外检测器（UV)和蒸发光散射检 测器（ELSD)。这两种检测器中，ELSD的响应信号独立于分子中的双键数目，也比UV检测器 更为灵敏，并且ELSD在梯度洗脱程序中能提供稳定的基线，因此，ELSD越来越多地用于磷 脂的高效液相色谱分析。 用于磷脂检测的色谱技术中，正相色谱主要基于头部基团极性大小分离不同种类 的磷脂；反相色谱分离磷脂主要基于磷脂上脂肪酸酰基链的疏水性不同，但是相比而言，后 者一般分离度较差，峰重合严重，因此应用较少。在生物样品等复杂样品的磷脂成分分析实 践中，正相色谱应用较多，常用的流动相一般分为两类：氯仿-甲醇-水（氨水）体系和正 己烷-异丙醇-水体系。前者在检测实践中有较好的应用，但是高效液相色谱仪中存在的 聚合物材质的配件在氯仿中可能发生溶胀或收缩，影响机器的气密性和使用寿命。而后一 体系多用于等度洗脱，但分离过程中往往存在分离时间长，峰形扩散严重，定量不稳定等问 题，需要配合更加优化的技术方案来使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，该方法基于 HPLC技术，包括如下步骤： (1)预制待测样品； (2)取检测量的预制待测样品，溶解于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物质 量，然后将残余物溶于正己烷和异丙醇按照体积比3:1的混合溶剂中，0. 22 ym孔径的有机 相滤膜过滤除杂； (3) HPLC 分析： 正相硅胶色谱柱，100mm X 4. 6mm，柱温25 °C ; 洗脱流速1. 5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为： 0.0 min, A 40%, B 57%, C 3% ； 8. Omin, A 40%, B 50%, C 10% ； 15. Omin, A 40%, B 50%, C 10% ； 15. lmin, A 40%, B 57%, B 3%； 24. Omin, A 40%, B 57%, C 3%； 其中，流动相A是含0.01~0.08% (体积百分含量）三乙胺的正己烷，流动相B 是异丙醇，流动相C是10~20%的乙酸溶液（体积百分含量）； (4)对比相同条件下PE、PI、PS、PC、SM和LPC混合标准品检测结果判定样品检测 结果。 本专利技术针对检测实践需求，并针对生物样品等复杂样品的磷脂组成含量分析特 点，提供了综合优化的基于整体硅胶柱的多重磷脂同时检测方案。本专利技术的方法操作简单、 快速准确、各组分分离良好、重复性高，易于检测实践中应用推广。【附图说明】 本专利技术附图5幅： 图1是磷脂标准曲线。 图2是六种磷脂混合标品的HPLC-ELSD多重检测图谱。 图3是仿刺参性腺磷脂的HPLC-ELSD多重检测图谱。 图4是鱼脑磷脂的HPLC-ELSD多重检测图谱。 图5是鸡脑磷脂多重检测的HPLC-ELSD图谱。【具体实施方式】 本专利技术提供一种复杂样品中的磷脂酰乙醇胺（PE)，磷脂酰肌醇（PI)，磷脂酰丝氨 酸（PS)，磷脂酰胆碱（PC)，鞘磷脂（SM)和溶血磷脂酰胆碱（LPC)六种磷脂进行快速分离及 多重检测方法。该方法基于高效液相色谱法（HPLC)，并针对检测目标样本特点综合优化。 所述多重检测方法的【具体实施方式】中，所述的步骤（3)中HPLC流动相中，流动相 A是含0. 04%三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是13%的乙酸溶液。 所另一【具体实施方式】中，所述的步骤（3)中HPLC分析配合蒸发光检测器（ELSD) 进行检测，分流模式，以空气作为雾化气，雾化气流速1. 0~2. OL/min;漂移管温度40~ 50°C。更优选发光检测器雾化气流速1. 7L/min ;漂移管温度45°C。 更为具体的实施方式中，本专利技术选用日立LaChrom Elite系列高效液相色谱仪，搭 配Alltech2000蒸发光检测器；色谱柱则选用Chroniolith? Performance-Si型正相硅胶色 谱柱（100mm X 4. 6mm)〇 本专利技术的上述检测方法应用于检测实践中，多用于针对动物组织等复杂生物样品 的检测，【具体实施方式】中包括预制待测样品的步骤，一般包括提取样品总脂及去除其中的 中性脂、糖脂和色素的步骤。本专利技术针对动物脑组织、性腺组织等待检样品，提供一种简单 便捷，并且处理后样品与后续检测过程契合度高的样品预置方法，包括如下步骤： a.取待测样品组织匀衆，按lg/lml比例与氯仿-甲醇（2:1，v/v)溶剂混合，搅拌， 静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得样品总脂； b.样品总脂溶于少量氯仿进行硅胶柱层析，4~6倍柱体积的氯仿洗脱中性脂， 2~4倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，然后用甲醇洗脱； c.甲醇洗脱组分溶于氯仿，-20°C冷冻保存，即得预制待测样品。 本领域技术人员容易理解，上述本专利技术的具体和/或优选的实施方式可以适当组 合，以获得包含这些优选技术特征的方案，如本申请的优选实施方式之一，是复杂样品中6 种磷脂的多重检测方法，包括如下步骤： (1)预制待测样品： a.取待测动物组织样品组织匀衆，按lg/lml比例与氯仿-甲醇（2:1，v/v)溶剂混 合，搅拌，静置十分钟后抽滤，收集滤液，脱水旋干得样品总脂； b.样品总脂溶于少量氯仿进行硅胶柱层析，4~6倍柱体积的氯仿洗脱中性脂， 2~4倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素，然后用甲醇洗脱； c.甲醇洗脱组分溶于氯仿，-20°C冷冻保存，即得预制待测样品； (2)取检测量的预制待测样品，溶解于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物质 量，然后将残余物溶于正己烷和异丙醇按照体积比3:1的混合溶剂中，0. 22 ym孔径的有机 相滤膜过滤除杂； (3) HPLC 分析： 日立LaChrom Elite系列高效液相色谱仪； Alltech2000蒸发光检测器，分流模式，以空气作为雾化气，雾化气流速1. 7L/ min ;漂移管温度45°C ; Chromolith?Performance-Si 型正相硅胶色谱柱，100mmX4. 6mm，柱温 25°C ; 洗脱流速1. 5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为： 0.0 min, A 40%, B 57%, C 3%； 8. Omin, A 40%, B 50%, C 10%； 15. Omin, A 40%, B 50%, C 10%； 15. lmin, A 40%, B 57%, B 3%； 24. Omin, A 40%, B 57%, C 3%； 其中，流动相A是含0. 04%三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是13% 的乙酸溶液； (4)对比相同条件下PE、本文档来自技高网...
【技术保护点】
复杂样品中6种磷脂的多重检测方法，包括如下步骤：(1)预制待测样品；(2)取检测量的预制待测样品，溶解于氯仿溶液，氮气吹干后精确称取残余物质量，然后将残余物溶于正己烷和异丙醇按照体积比3:1的混合溶剂中，0.22μm孔径的有机相滤膜过滤除杂；(3)HPLC分析：正相硅胶色谱柱，100mm×4.6mm，柱温25℃；洗脱流速1.5mL/min，按体积比，梯度洗脱的流动相为：0.0min，A 40％，B57％，C 3％；8.0min，A 40％，B 50％，C 10％；15.0min，A 40％，B 50％，C 10％；15.1min，A 40％，B 57％，B 3％；24.0min，A 40％，B 57％，C 3％；其中，流动相A是含0.01～0.08％三乙胺的正己烷，流动相B是异丙醇，流动相C是10～20％的乙酸溶液；(4)对比相同条件下PE、PI、PS、PC、SM和LPC混合标准品检测结果判定样品检测结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢航，胡建恩，武龙，赵慧，陈慧民，李晶晶，
申请(专利权)人：卢航，大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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