本发明专利技术提供了一种新型中性植酸酶，通过随机突变的方法对植酸酶PHYA进行改造，获得一种突变体蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5。本发明专利技术筛选到的植酸酶突变体PHYAT5最适反应pH为6.5，在pH6.5-7.0范围内，能保持80％以上的酶活，当pH为8.0时，仍能保持35％的酶活，取得了意料不到的技术效果。与野生型相比，植酸酶突变体PHYAT5在中性范围内的酶活水平得到显著提高，最适反应温度未发生明显变化。所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料中，从而有利于减少饲料中无机磷酸盐的添加，降低养殖成本，同时还能有效减少水产动物粪磷对环境的污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体内容涉及一种中性植酸酶突变体及其在水产饲料中的应用。技术背景磷是鱼类所必需的重要矿物元素之一，鱼体对磷的需要量高于其他矿物元素但饲料中过量的磷被认为是造成水体富营养化的重要因素之一。因此，通过提高鱼类对原料中磷的利用率，适当调整饲料中磷的含量，使其更接近鱼的需要量，来降低养殖鱼类磷的排放量，是减少水环境污染的重要途径。植酸酶作为一种由微生物发酵生产的酶制剂，可分解植酸和植酸盐，促进饲料中植酸和植酸盐的分解，使磷、磷酸根结合的内源性酶和其它营养素得以释放和利用，减少粪磷对环境的污染，节省无机磷酸盐的添加。多项研究证明，在水产养殖中植酸酶替代部分磷酸二氢钙表现出了较好的养殖效果和环境效益。罗琳等(2007)在基本花鲈试验研究表明用中性植酸酶部分替代磷酸二氢钙是完全可行的，并得出中性植酸酶1000U/kg替代80％左右的磷酸二氢钙综合生长效果最佳，也证明中性植酸酶存在一定的广谱应用性。近期研究还表明中性植酸酶在有胃和无胃水产动物均表现较好性能，可以在水产动物胃肠道中释放大量的有效磷。但当前市场上的植酸酶以酸性植酸酶为主，在pH 2.5和5.5条件下活性最高，而在无胃水产动物消化道中，由于没有胃酸的分泌，消化道中pH约呈中性，不利于酸性植酸酶发挥作用。因此目前急需开发一种在中性pH范围内具有较高酶活的植酸酶。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种新型中性植酸酶及其应用。本专利技术通过随机突变的方法对植酸酶PHYA进行改造，获得一种突变体蛋白，其pH适用范围更偏向中性条件，有利于其在水产饲料中的广泛应用。本专利技术一方面提供了一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。所述植酸酶的一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本专利技术另一方面提供了一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的植酸酶的突变获得的，其一种氨基酸序列为SEQ ID NO：3或5，对应的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4、6。本专利技术另一方面提供携带有编码序列为SEQ ID NO：3或5的植酸酶突变体基因的质粒。本专利技术再一方面提供了一种重组黑曲霉，是将上述质粒转入黑曲霉中构建得到的。本专利技术还提供了上述植酸酶突变体在水产饲料中应用。本专利技术筛选到的植酸酶突变体PHYAT5最适反应pH为6.5，在pH6.5-7.0范围内，能保持80％以上的酶活，当pH为8.0时，仍能保持35％的酶活，取得了意料不到的技术效果。与野生型相比，植酸酶突变体PHYAT5在中性范围内的酶活水平得到显著提高，最适反应温度未发生明显变化。所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料中，从而有利于减少饲料中无机磷酸盐的添加，降低养殖成本，同时还能有效减少水产动物粪磷对环境的污染。附图说明图1为植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的pH-相对酶活曲线图；图2为植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的温度-相对酶活曲线图。具体实施方式本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。实施例1 植酸酶基因的获得根据公共基因数据库中的基因序列，优化了合成基因的密码子并人工合成来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的植酸酶基因PHYA(序列为SEQ ID NO：2)，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。PCR引物和反应条件如下：引物1(F)：GCGCGAATTCATGAGCTTCCGGTCCCTG引物2(R)：TAAAGCGGCCGCTTAGGCGAAGCACTCGGC反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1.5min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，PHYA基因大小为1395bp。实施例2 植酸酶突变体的构建及筛选为了提高植酸酶PHYA的在中性条件下的酶活水平，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。以PHYA基因为模板，以实施例1所述引物1、2用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用pH 5.0的缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶突变子的大肠杆菌细胞裂解液。分别取出40μl裂解液至两块新的96孔板，其中一块稀释到pH 5.0的缓冲液中，另一块稀释到pH 7.0的缓冲液中，分别加入相同pH值的20μl底物，于37℃反应30min后，加入40ul终止液混匀以终止反应，室温放置10min显色，分光光度计415nm处测定吸光值。实验结果显示：大部分植酸酶突变体在pH 5.0条件下的酶活高于在pH 7.0条件下的酶活，只有少数突变体在pH 7.0条件下酶活高于在pH 5.0条件下的酶活，还有一些突变体在pH 5.0和pH7.0条件下的酶活水平比突变前均大幅下降。申请人通过对在pH 7.0条件下的酶活水平显著高于在pH 5.0条件下酶活的突变体进行DNA测序，最终获得了能提高植酸酶PHYA在中性pH范围内酶活水平的突变组合：S87R、G159K、S198D三点突变体和A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五点突变体。将S87R、G159K、S198D三点突变体命名为PHYAT3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。将A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五点突变体命名为PHYAT5，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：6。实施例3 重组表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种植酸酶，其特征在于，所述的植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
2.编码权利要求1所述的植酸酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
4.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
5.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓东，张霞，吴秀秀，王华明，
申请(专利权)人：青岛玛斯特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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