本发明专利技术提供了一种针对多样本多位点的乙型肝炎病毒多耐药位点检测方法，包括提取HBV基因组DNA、PCR扩增、PCR产物混合纯化、再次PCR扩增、文库质检定量、上机测序及数据分析等步骤。本发明专利技术的方法能够在同一个文库中同时检测分析多个HBV样品的多个耐药位点突变状态。使得通过高通量测序技术检测临床HBV病毒耐药突变成为可能，该流程具有起始样本量小、针对性强、成本低、通量高，准确性高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量 检测方法及其相关的试剂盒及装置。
技术介绍
乙型肝炎病毒（HBV)感染呈世界性分布，全球约有3. 6亿感染者，每年约有100万 人死于与HBV相关的肝脏疾病。 目前，核苷（酸）类似物（NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一。核苷类似物 主要有拉米夫定（LVD)、阿德福韦酯（ADV)、恩曲他滨（FTC)、恩替卡韦（ETV)、替诺福韦酯 (TDV)、替诺福韦酯（TDV)等。 随着核苷类似物临床治疗方案的不断优化，核苷类似物对慢性乙型肝炎的疗效已 得到肯定。因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的 肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而 导致治疗的失败，给乙肝的治疗带来了极大的困难。因此，非常有必要对HBV耐药位点进行 检测，作为临床用药及治疗的参考。目前，临床检测HBV耐药位点突变常用技术有DNA -代 测序以及荧光定量PCR技术等，这类方法灵敏度低、准确性差，具有一定的局限性。
技术实现思路
针对HBV病毒的多耐药位点突变检测的技术现状，本专利技术提出一种针对多样本的 HBV多耐药位点高通量检测方法，该方法能够在一个文库中同时分析多个样本的多个位点 的突变状况。该方法具有灵敏度高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点。 本专利技术提供了，包括以下步 骤： 步骤1 :提取检测对象各个样本中的HBV基因组DNA ; 步骤2 :针对不同样本使用不同的PCR引物进行PCR扩增； 步骤3 :将步骤2中所得到不同样本的的PCR产物按照相同的摩尔数混合，得到混 合后的PCR产物； 步骤4 :将混合后的PCR产物使用通用引物进行第二次PCR扩增，获得测序文库并 进行文库质检定量； 步骤5 :上机测序及数据分析得到耐药位点相关信息。 为进一步优化上述技术方案，本专利技术的技术方案还包括： 上述步骤2的PCR扩增中使用的引物为针对乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个 耐药位点进行设计。 上述步骤4还包括使用第二次PCR扩增的引物对扩增产物进行1. 5%的琼脂糖凝 胶电泳以确认产物情况的步骤，以及随后进行的对扩增产物纯化的步骤。 上述步骤4中的通用引物包括一条通用的上游引物，和一条带有标签序列的下游 引物，所述步骤4中的PCR循环次数为4-10轮。 对扩增产物的纯化方法包括磁珠纯化、纯化柱纯化、琼脂糖凝胶电泳纯化。 对扩增产物的纯化方法为磁珠纯化。 上述步骤5中的上机测序通过二代测序平台进行；步骤5中的数据分析通过对所 得测序数据与乙型肝炎病毒的参考序列进行对比，最终对所测片段每个突变位点的突变情 况进行分析，得到耐药位点相关信息。 上述乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点为选自V173L、L180M、M204V/I、 A181T/V、N236T、S202G、M250V、T184G、I169T、A194T 中的至少一种。 本专利技术还提供了一种利用上述的方法检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的试 剂盒。 本专利技术还提供一种检测乙型肝炎病毒耐药位点突变状态的系统，包括： 核酸抽提装置，所述核酸抽提装置适用于从乙型肝炎病毒宿主分离乙型肝炎病毒 核酸样本； 基因扩增装置，所述的基因扩增装置用于对核酸样本进行扩增，以便得到第一扩 增产物； 测序装置，所述测序装置与所述扩增装置相连，并且适于对所述扩增产物进行测 序，以便得到测序结果；以及 分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定所述 HBV核酸样本中是否存在突变。 为了优化上述系统，还可以采用以下技术方案： 分析装置进一步包括比对单元，所述比对单元中存储有参考序列，用于将所述测 序结果与参照序列进行比对，以便确定所述核酸样本是否存在突变。 本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：本专利技术针对HBV 病毒的多耐药位点突变检测，提供了一种针对多样本的HBV多耐药位点高通量检测方法， 该方法能够在一个文库中同时分析多个样本的多个位点的突变状况。该方法具有灵敏度 高、针对性强、成本低、通量大，准确性高等优点。【附图说明】 图1是根据本专利技术一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法的流程 不意图：以及 图2是根据本专利技术一个实施例的确定HBV核酸样本中突变位点类型的系统的结构 示意图。【具体实施方式】 本专利技术提供了一种本专利技术提供了一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检 测方法，包括以下步骤： 步骤1 :提取检测对象各个样本中的HBV基因组DNA ; 步骤2 :针对不同样本使用不同的PCR引物进行PCR扩增； 步骤3 :将步骤2中所得到不同样本的的PCR产物按照相同的摩尔数混合，得到混 合后的PCR产物； 步骤4 :将混合后的PCR产物使用通用引物进行第二次PCR扩增，获得测序文库并 进行文库质检定量； 步骤5 :上机测序及数据分析得到耐药位点相关信息。 本专利技术提供了一种针对多样本多位点的乙型肝炎病毒多耐药位点检测方法，主要 技术流程：提取HBV基因组DNA、第一轮PCR、PCR产物混合、第二轮PCR、文库质检定量、上机 测序及数据分析。具体如下： 根据本专利技术的一个实施例，将核酸标签引入到测序文库中的方法并不受特别限 制。既可以在构建文库的过程中，按照常规方法，将标签引入到测序文库中。根据本专利技术的 一个实施例，可以在对待测序的核酸样品进行预处理，通过PCR扩增的方法，将标签引入到 扩增产物中，之后通过常规的构建文库的方法，针对所得到的含有标签的扩增产物构建测 序文库，从而得到含有标签的测序文库。由此，可以在对多个核酸样品进行扩增之后，就可 以混合在一起，进行文库构建，从而容易获得含有各自核酸标签序列的多种核酸样本的测 序文库。 根据本专利技术的一个实施例，HBV核酸样本的来源并不受特别限制。根据本专利技术的一 些具体实施例，HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离的。根据本专利技术的进一步的实施例，优 选HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本中分离的。由此，可以有效地对乙肝患者的HBV核 酸样本进行检测。 根据本专利技术的一个实施例，第一轮PCR的引物针对HBV基因组的多个耐药位点设 计，包含部分Illumina接头序列。[当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：提取检测对象各个样本中的HBV基因组DNA；步骤2：针对不同样本使用不同的PCR引物进行PCR扩增；步骤3：将步骤2中所得到不同样本的的PCR产物按照相同的摩尔数混合，得到混合后的PCR产物；步骤4：将混合后的PCR产物使用通用引物进行第二次PCR扩增，获得测序文库并进行文库质检定量；步骤5：上机测序及数据分析得到耐药位点相关信息。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王曦路，吴奇涵，窦同海，陈静，徐敏杰，
申请(专利权)人：上海昂朴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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