本发明专利技术公开了一种羧基修饰的基因芯片基片及其制备方法，以普通玻璃基片为载体，基片表面引入羧基活性官能团，可与氨基修饰的DNA模板进行化学反应共价牢固结合。其制备方法包括玻璃基片表面清洁工艺、玻璃基片表面硅烷化修饰工艺、玻璃基片表面羧基修饰工艺。本发明专利技术中制备方法包括清洁活化玻璃芯片基片的表面，并进一步修饰成酰胺键共聚物表面，然后使用自动点样仪点样固定氨基模板。与常规的醛基修饰相比很大程度上提升了芯片基片的品质和修饰工艺。本发明专利技术制备的羧基修饰芯片基片具有荧光背景低，信号强度大，固定效率高，制造成本低，步骤简单易行等优点。易于产业化和流程化，可广泛应用于各类基因芯片上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因领域，具体涉及和应 用。
技术介绍
生物芯片（biochip)技术是80年代发展起来的一门新兴技术，是指利用微细加 工技术并结合有关的化学合成技术，将大量探针分子固定于载体即微小的基片（如玻璃、硅 片、有机材料薄膜等）上，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对靶 分子的序列和数量进行分析检验的微型器件。它可以将成千上万乃至几十万个与生命相关 的信息集成在一块厘米见方的芯片上，对基因、抗原活体细胞和组织等进行测试分析。近年 来，以基因芯片为代表的生物芯片技术得到了迅猛发展，目前已有多种芯片出现。基因芯片 技术是指将大量靶基因（或基因片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片等载体 上所形成的矩阵。将待测样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用荧光扫 描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似于传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高 效、平行性分析生物信息的目的。基因芯片技术是一种高通量的现代生物检测技术，在功能 基因研宄、新药筛选、疾病的基因诊断等领域具有广泛的应用。 基因芯片制备是一个非常复杂的过程，制备过程的操作复杂化容易造成检测结果 的不稳定，从而影响基因芯片的产业化和流程化过程。常规玻璃芯片基片制备方法多采用 醛基或氨基修饰，制备的醛基片或氨基片具有多种缺点，由于修饰方法的不同或钝化反应 的效率问题，荧光标记的杂交探针或荧光单体检测时经常出现背景较深，低信噪比问题。在 基因芯片的应用过程中，检测的灵敏度和选择性是两个非常重要的考察参数。所以，制作一 种理想的，具有高的固定化效率，并且不与反应体系中的其他物质进行非特异性反应的芯 片基片成为了基因芯片技术的关键。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术的不足，解决常规芯片制备过程复杂，难以流程化问 题；降低常规芯片荧光背景高问题；解决常规芯片核酸固定效率低问题；解决常规芯片核 酸信号强度低问题；本专利技术的第一个目的在于提供了一种羧基修饰的基因芯片基片的制备 方法。本专利技术的第二个目的是提供了上述羧基修饰的基因芯片基片。本专利技术的第三个目的 是提供了上述羧基修饰的基因芯片基片在核酸DNA固定方面的应用。 技术方案：为了解决上述目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种羧基修饰的基 因芯片基片的制备方法，包括以下步骤：1)玻片表面清洗工艺；2)玻片表面通过硅烷化试 剂进行硅烷化修饰工艺；3)羧基修饰工艺；所述硅烷化试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷和 质量分数为95%的乙醇以体积比为1 :45~49配制而成。采用分子自组装技术将硅烷化试 剂组装在羟基化的玻璃基片表面，形成一层氨基结尾的单分子自组装膜。 所述步骤1)玻片表面清洗工艺具体包括以下步骤： la) 预清洗处理：将玻璃片全部浸入去离子水中，然后在水中轻轻擦拭玻璃表面，玻璃 两面都擦拭过后用洗瓶冲洗6-8次，氮气吹干，放入干净培养皿中； lb) 甲醇-盐酸溶液清洗：将预清洗处理好的玻片放入装有甲醇-盐酸培养皿中；用保 鲜膜将培养皿封闭，并放到摇床上SOrpm清洗30分钟；用镊子将玻片从甲醇-盐酸溶液中 取出，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干； lc) 硫酸清洗：将甲醇-盐酸溶液清洗好的玻片放入盛有硫酸的干净培养皿中，用保鲜 膜将培养皿封闭，并放到摇床上SOrpm清洗30分钟后，倒掉硫酸；用镊子将玻片取出，用去 离子水冲洗6-8次，氮气吹干；将玻片放入盛有95%乙醇培养皿中80rpm清洗10分钟，结 束后取出玻片放入盛有去离子水的培养皿中80rpm清洗5分钟；取出玻片用去离子水冲洗 6-8次，氮气吹干；使用超声波清洗仪进行残酸的去除和清洗，去离子水冲洗后，氮气流吹 干。 所述步骤2)玻片表面硅烷化修饰工艺具体包括以下步骤： 2a)配制硅烷化试剂，配制全程避光，室温保存； 2b)将表面清洗后的玻片放入盛有硅烷试剂的培养皿内，用锡箔纸遮光，80rpm反应30 分钟，取出玻片，去离子水冲洗6-8次，氮气吹干； 2c)将步骤2b)处理后的玻片放入盛有95%乙醇的培养皿内，80rpm清洗10分钟。取 出玻片放入盛有去离子水的培养皿内80rpm清洗5分钟，取出玻片，去离子水冲洗6-8次， 氮气吹干； 2d)将步骤2c)处理后的玻片放入干净的干燥培养皿，放入电热恒温鼓风干燥箱 120-125°C避光烘烤45-55分钟；将从烘箱取出的玻片避光放至室温；实现硅烷化试剂与玻 璃基片的完全组装。 所述步骤3)羧基修饰工艺具体包括以下步骤： 3a)配制聚丙烯酸溶液：将超纯水和聚丙烯酸以1000-1200 :1的体积比混合，涡旋震荡 均匀，用盐酸调PH至8. 0 ;室温保存。聚丙烯酸溶液具有丰富的羧基活性官能团，可制备出 带有活性羧基（-C00H)的基因芯片片基，基因芯片片基上的活性羧基（-C00H)可以与5'-端 或者3'-端被修饰有活性氨基（-NH2)核酸的氨基反应，生成酰胺共价键（-C0-NH-)，从而将 核酸通过酰胺键固定在羧基修饰的基因基片表面。 3b)在盛有配制好的聚丙烯酸的培养皿中放入硅烷化后的玻片，保鲜膜密封，锡箔 纸避光，80rpm室温反应30分钟，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；羧基玻片4°C密封真空 保存。 由于聚丙烯酸具有丰富的羧基集团，基片表面组装一层高密度的羧基分子层，固 定模板效率高。 上述的制备方法制备得到的羧基修饰的基因芯片基片。 上述的羧基修饰的基因芯片基片在核酸DNA固定方面的应用。 有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点是：本专利技术中制备方法包括清洁活化 玻璃芯片基片的表面，并进一步修饰成酰胺键共聚物表面，然后使用自动点样仪点样固定 氨基模板。与常规的醛基修饰相比很大程度上提升了芯片基片的品质和修饰工艺。本专利技术 制备的羧基修饰芯片基片具有荧光背景低，信号强度大，固定效率高，制造成本低，步骤简 单易行等优点。易于产业化和流程化，可广泛应用于各类基因芯片上。【附图说明】 图1为本专利技术羧基修饰的基因芯片基片表面修饰原理图； 图2为羧基芯片点样试验中点样矩阵示意图； 图3为羧基芯片和普通醛基芯片的Cy3荧光扫描背景图片，与醛基片作比较的荧光信 号柱形比较图； 图4为羧基芯片和普通醛基芯片核酸样品固定能力的Cy3荧光扫描图片及柱形对比 图； 图5为羧基修饰基片与普通醛基片固定率的荧光信号扫描图片及柱形对比图。【具体实施方式】 下面结合具体实施实例，进一步阐释本专利技术： 实施例1:以羧基修饰芯片为载体基片的基因芯片制备 羧基芯片基片采用的是普通无色玻璃片，其尺寸为长：76_，宽：25_，厚：1_。其制备 过程包括玻片表面清洗工艺、玻片表面硅烷化修饰工艺、羧基修饰工艺。该制备过程芯片基 片表面的结构变化示意图如图1所示。羧基修饰基因芯片基片制备的具体步骤为： A) 在直径15cm培养皿中倒入加有洗涤液的去离子水，向其中轻轻放入7张玻片，轻轻 擦拭玻片表面，玻片两面均擦拭过后用去离子水冲洗两面6-8次，氮气吹干，放入干净的培 养皿中（玻片之间不能叠加）； B) 分别量取25ml甲醇与浓盐酸于100mL干净烧杯中，用磁力搅拌器搅匀后倒入装有玻 片的培养皿中（此时玻片朝上一面规定为正面，玻片之间不能叠加)，用保鲜膜将培养皿密 封，放到脱色摇床上80本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种羧基修饰的基因芯片基片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）玻片表面清洗工艺；2）玻片表面通过硅烷化试剂进行硅烷化修饰工艺；3）羧基修饰工艺；所述硅烷化试剂，所述硅烷化试剂包括3‑氨丙基三乙氧基硅烷和质量分数为95%的乙醇以体积比为1：45～49配制而成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱会英，戴琳超，陆祖宏，
申请(专利权)人：南京普东兴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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