一种增加脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法技术

本发明专利技术公开一种提高脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法。该方法以脐带血造血干细胞为标本细胞，在含有白黎芦醇的特定培养基中进行定向分化。该含有白藜芦醇的特定培养基使巨核祖细胞定向分化操作更简便安全和高效。在脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化培养过程中，加入细胞因子的同时加入白黎芦醇，达到了增加巨核祖细胞生成数量的效果，本发明专利技术的操作简便，成本低，得到的巨核祖细胞安全性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞
，具体涉及一种增加脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化数量的方法。
技术介绍
造血干细胞具有自我更新能力并能分化为各种血细胞的前体细胞，最终形成血液细胞，包括红细胞、白细胞和血小板。造血干细胞主要来源于骨髓、脐带血和外周血，在临床上用于移植治疗各种恶性血液疾病和某些免疫疾病。1989年第一例脐带血移植成功，至今脐带血的移植/输注已是临床上治疗血液系统疾病和某些免疫疾病的重要方案。与骨髓造血干细胞和外周血造血干细胞一样，脐带血造血干细胞在移植前，受者通常要进行大剂量放疗/化疗以达到清髓的效果，尤其是恶性血液肿瘤患者，在放疗/化疗后，在肿瘤细胞被杀伤的同时受者的造血系统同样也受损严重，在一段时间内受者的血小板严重缺乏，导致容易出血乃至死亡，需要输注血小板以支持。而在脐带血造血干细胞移植后，血小板的恢复进展也是影响移植成败的重要原因。目前普遍认为脐带血移植后血小板恢复较慢是由脐带血中巨核祖细胞数量不充裕且分化成熟迟缓而造成。巨核细胞是造血干细胞逐渐分化而产生的，造血干细胞先分化为巨核祖细胞(Megakaryocytic progentitor cell，MKPC)然后又进一步分化为成熟的巨核细胞，最终释放出血小板。近年发现，异体脐带血造血干细胞在体外定向分化为巨核祖细胞后，在造血干细胞移植中输注到受者体内，是有望解决放疗/化疗后血小板缺乏和脐带血移植后血小板恢复延迟的重要方法。脐带血造血干细胞体外定向分化扩增是干细胞领域的研宄重点之一，向红系祖细胞、粒系祖细胞方向分化的研宄已多有报道。当前，脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化扩增普遍采用细胞因子组合进行，通常有TPO，FLT, IL-3，IL-6，SCF等。白藜芦醇是一种天然的植物抗体，当植物遭遇到真菌感染、紫外线等不利条件时会产生该酚类化合物，对植物起保护、防御作用。白藜芦醇存在于葡萄科、百合科、豆科等70多种植物中。白藜芦醇的抗心血管疾病作用因“法国悖论”而始被学者们认识，随着世界范围内的进一步研宄，白藜芦醇的其他生物学作用逐渐被发现。白藜芦醇具有抗肿瘤、抗炎症、免疫调节、抗衰老等多种生理作用。通过分子生物学及信号通道方面的研宄发现，白藜芦醇可通过抑制MAPK或NF-kB通道的信号传导促进癌细胞凋亡。在造血干细胞的分化方面，白藜芦醇可加速红系祖细胞的成熟，在体外扩增时提高CFU-GM的集落生成数量。脐带血采集后需去除血浆和红细胞，以富集富含造血干细胞的总有核细胞(TNC)。除了造血干细胞，总有核细胞还含有大量各种细胞。复杂的成分对体外扩增效率有不良影响。通过磁珠分选虽然可获得较纯的造血干细胞以更优化体外扩增，但增加的成本对需要大量扩增的情况有很大制约，同时更多的操作步骤也带来更大的污染风险。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种提高脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法。该方法添加天然的化合物白藜芦醇，培养后获得干细胞产品，制备过程简单、可靠且重复性好，且成本低廉。通过上述方法，在已知临床应用所需要的巨核祖细胞数量时，可以减少制备时间，为临床应用提供了更可靠和快捷的支持。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种提高脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法，以脐带血造血干细胞为标本细胞，在含有白黎芦醇的特定培养基中进行定向分化。所述的含有白黎芦醇的特定培养基中白黎芦醇的浓度梯度设定在5?25 ymol/L之间；更优选为15 ymol/L ；所述的含有白黎芦醇的特定培养基，在STEMCELL公司的Stemspan培养基中加入细胞因子 IL-3 (20ng/mL)、IL-6 (50ng/mL)、SCF (50ng/mL)和 TP0(50ng/mL)。一种提高脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法，包括以下具体步骤:(I)白藜芦醇溶解于细胞保护剂中，配制成白藜芦醇储存溶液；(2)配制特定培养基，将步骤⑴配制的白藜芦醇储存溶液添加到特定培养基中，得到含有白藜芦醇的特定培养基，对照组中白藜芦醇浓度为O ;(3)脐带血造血干细胞的分离:采集的新鲜脐带血，通过Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经过离心后，收集白膜层，加生理盐水重悬再离心；加入细胞保护剂后程控降温，储存于液氮中；(4)诱导分化前，脐带血造血干细胞解冻，加生理盐水重悬洗涤再离心，收集得到脐带血造血干细胞；(5)将步骤(4)得到的脐带血造血干细胞按相同密度接种于6孔培养板中，并加入等量的步骤(2)得到的含有白藜芦醇的特定培养基；在371，二氧化碳浓度为5%的条件下培养；在第I?14天分别进行细胞计数并收集悬浮生长的细胞进行流式细胞仪检测。步骤(I)中所述的白藜芦醇的纯度是多99%, GC;白藜芦醇储存溶液浓度为10mmol/L,该浓度为储存浓度，工作浓度跟储存浓度一致，须放置于4°C遮光保存。步骤⑴和(3)中所述的细胞保护剂优选为二甲基亚砜(DMSO)与低分子右旋糖酐(Dextron)按体积比1:1混合得到的混合液。步骤(2)中所述的特定培养基包含STEMCELL公司的Stemspan培养基、IL-3(20ng/mL)、IL-6 (50ng/mL)、SCF (50ng/mL)和TP0(50ng/mL)细胞因子，所用的细胞因子全称分别为促血小板生成素(Thrombopoietin，ΤΡ0)、人白细胞介素_3 (Interleukin-3，IL-3)、人白细胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)、人干细胞生长因子(Stem cell factor, SCF)，共 4 种细胞因子。步骤(2)中所述的含有白藜芦醇的特定培养基中白藜芦醇的浓度梯度为5?25 μ mol/L ;更优选为 15 μ mol/L ；步骤(4)所述的脐带血造血干细胞，在进行定向分化培养前从液氮中解冻复苏。在脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化培养过程中，加入细胞因子的同时加入白黎芦醇，达到了增加巨核祖细胞定向分化数量的效果，本专利技术的操作简便，成本低，得到的巨核祖细胞安全性高。本专利技术的制备方法通过在脐带血体外向巨核祖细胞定向分化培养的过程中加入白藜芦醇，在第7天、第14天检测巨核祖细胞的生成量。本专利技术通过添加低廉的白藜芦醇提高巨核祖细胞的定向分化效率。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果:(I)本专利技术有效提高了脐带血造血干细胞向巨核祖细胞定向分化的数量，最终获得更大量的巨核祖细胞，成本低廉。(2)本专利技术使用的含有白藜芦醇的特定培养基是白藜芦醇培养基，为独有配置的特定培养基，该含有白藜芦醇的特定培养基使巨核祖细胞定向分化操作更简便安全和高效。(3)本专利技术配制的白藜芦醇储存溶液，是把白藜芦醇溶解于二甲基亚砜(DMSO)和低分子右旋糖酐(Dextron)体积比为1:1的细胞保护剂中。二甲基亚砜是常用的有机溶剂，但对细胞有一定的毒性作用，低分子右旋糖酐对细胞有保护作用，该种方法配制的白藜芦醇储存液用于细胞培养，不但保证了白藜芦醇在细胞培养过程中药效的发挥，而且较少了二甲基亚砜对细胞的毒性作用。【附图说明】图1是各浓度白藜芦醇培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本在第1、7、14天的⑶41+表面抗原表达情况的结果图。图2是各浓度白藜芦醇培养基作用下，脐带血造血干细胞各样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法，其特征在于：以脐带血造血干细胞为标本细胞，在含有白黎芦醇的特定培养基中进行定向分化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：嵐山芮，魏伟，袁嘉恩，
申请(专利权)人：广州市天河诺亚生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44