本发明专利技术涉及脐带血血液制品，公开了一种从脐带血中扩增Ｖα２４ＮＫＴ细胞的方法，目的是克服Ｖα２４ ＮＫＴ细胞在脐血中的含量极少，很难用于临床研究和治疗的缺陷，该方法包括下列步骤：Ａ．脐带血采集和保存；Ｂ．脐带血单个核细胞纯化；Ｃ．脐带血单个核细胞中Ｖα２４ＮＫＴ细胞体外扩增。本发明专利技术从脐带血中扩增Ｖα２４ ＮＫＴ细胞的方法具有扩增效率高，特异性强，获得的Ｖα２４ ＮＫＴ细胞具有分泌ＩＮＦ－γ和ＩＬ－４的双向免疫调控能力，在临床研究和治疗中具有非常广泛的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脐带血血液制品，具体涉及一种从脐带血中扩增Va24 NKT细胞的方法。
技术介绍
自然杀伤T细胞(NKT)是一类具有NK受体和T细胞受体且显示 NK细胞和T细胞两方面性质的淋巴细胞。由于其表型功能与T细胞、 B细胞和NK细胞等免疫细胞有所不同，近年来颇受重视。NKT细胞具 有高度保守的TCR表型(TCRVa 14/VP8——小鼠Va 14NKT细胞， TCR V a 24/V P 11——人Va24 NKT细胞)，同时共表达NK细胞特有 标志CD161。 Va24NKT细胞识别由CDld分子提呈的特异糖脂分子并 具有迅速分泌大量细胞因子，参与机体的先天性免疫及获得性免疫反应 的能力。研究发现，Va24NKT细胞在控制感染，抗肿瘤，克服移植排 斥，以及抑制自身免疫性疾病(I型糖尿病，系统性红斑狼疮，硬皮症 等)的发生中发挥着至关重要的作用。糖脂类抗原，如a-半乳糖神经酰胺(a-Galcer)可用于诱导NKT细 胞体外扩增。由于a-GalCer对NKT的激活受CDld分子限制，目前一 般采用树突状细胞来提呈a -GalCer，通过免疫磁珠纯化CD4'CD8— NKT 建立NKT细胞系。Va24 NKT细胞的TCR识别树突状细胞的CDld递 呈的a -GalCer，同时其表面的CD28及CD154分别与树突状细胞表面的 CD80/CD86及CD40相互作用，激活树突状细胞产生IL-12和IL-18， 作用于Va24NKT表面的IL-12R和IL-18R，使Va24NKT分泌高水平的 IL-4和IFN- Y 。 Va24NKT细胞产生IL-4只需有CD28-CD80/CD86 — 个共刺激信号，但产生IFN- Y则需要CD28-CD80/CD86和CD154-CD40 两个共剌激信号，并且需要树突状细胞产生的内源性IL-12的参与。单 核系细胞表面也弱表达CDld分子并具有很强的激活CDld限制性免疫 反应的能力，因此Va24NKT细胞可以通过外周血单个核细胞(PBMNC ) 体外培养过程中加入a -GalCer来扩增。Va24NKT细胞具有多种免疫调节功能1. NKT细胞的抗感染作用研究显示NKT细胞参与了多种感染的应答，例如参与对疱疹病毒、 分支杆菌、李斯特菌、疟原虫等的免疫反应过程，这与NKT细胞特异 性激活可导致NK细胞的大量增殖与细胞毒效应有关。NKT细胞也可能 通过分泌IL-4负性调节Thl细胞的生成，作为对细菌或细菌成分如脂 多糖的感染的应答。2. NKT细胞的抗肿瘤作用尽管体外试验支持NKT细胞可直接作为抗肿瘤效应细胞而发挥作 用，但不能排除NKT细胞的抗肿瘤功能主要是通过激活其它免疫效应 细胞，如NK细胞来实现的可能。a -GalCer通过激活NKT细胞产生IFN-Y抑制肿瘤的转移，也可能通过NKT细胞激活B淋巴细胞而产生抗肿 瘤效应。NKT细胞在受到a -GalCer和IL-12激活后，通过穿孔素依赖 的NK细胞介导的方式杀伤各种肿瘤细胞，而且不依赖肿瘤耙细胞是否 表达CDld。3. NKT细胞对自身免疫性疾病的抑制作用已经证实NKT细胞的数量下降，或功能改变与自身免疫性疾病的发 生有关。同卵双胞胎之间，糖尿病患病个体与无糖尿病个体相比，NKT 细胞的数量在前者明显降低。由这些糖尿病患者体内经分离得到的Va24 NKT细胞克隆在产生IL-4方面存在缺陷。NKT细胞在机体免疫自稳中 起着很重要的作用，NKT细胞中含有高比例的自身杀伤性T细胞，但该 杀伤机制与其抗肿瘤机制不同，是通过Fas/FasL途径而实现的。4. NKT细胞对GVHD的抑制作用骨髓中CD4'CD8' NKT细胞被发现在异基因骨髓移植后以一种IL-4 依赖方式，在防止GVHD中起着重要作用，NKT细胞能够生成大量IL-4 能力提示NKT细胞对Th2应答具有驱动作用。研究还发现，在v a 14 NKT 细胞缺陷小鼠，给予过继性输注va 14NKT细胞可导致移植物在受者动 物体内的长期植活。脐带血是一种来源广泛的新资源，其中的低免疫原性细胞正日益受 到人们的关注。由于Va24NKT细胞在脐血中的含量极少，很难用于临床研究和治疗，因此寻找到一种高效的体外扩增脐血NKT细胞的方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服Va24 NKT细胞在脐血中的含量极少，很难用 于临床研究和治疗的缺陷，提供一种从脐带血中扩增Voc24NKT细胞的方法。本专利技术公开了一种从脐带血中扩增Vcc24NKT细胞的方法，包括下 列步骤A. 脐带血采集和保存；B. 脐带血单个核细胞纯化；C. 脐带血单个核细胞中Va24NKT细胞体外扩增； 上述步骤A中，脐带血采自新生儿脐带和胎盘，采用ACD-B抗凝血袋收集，继以加入HES液中，吹打均匀后，于4。C冰箱中放置0-6小时。上述步骤B中，脐带血采用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，悬 浮于完全培养液中。上述步骤C中，将新鲜分离的脐带血单个核细胞，加入IL-2和a-半乳糖神经酰胺，于37"C、 5。/。C02及饱和湿度的条件下培养。其中， IL-2含量为5-20U/mL， a-半乳糖神经酰胺含量为100-200ng/mL。上述步骤C中，脐带血单个核细胞培养时浓度为2xl05-lxl06/mL， 最佳浓度为5xl05/mL。上述步骤C中，脐带血单个核细胞扩增时间是7-14天，最佳时间 是7天。本专利技术公开了从脐带血中扩增Va24NKT细胞的方法，更具体的是 采用IL-2和a-半乳糖神经酰胺(a-Galcer)扩增脐血中的Va24 NKT细 胞。本专利技术的从脐带血中扩增Va24NKT细胞的方法具有扩增效率高， 特异性强，获得的Va24 NKT细胞具有分泌INF-Y和IL-4的双向免疫调 控能力。附图说明图1是采用IL-2和a-半乳糖神经酰胺(a-Galcer)扩增脐带血(CB) 与外周血(PB) Va24NKT细胞扩增效果图。图2 (a)是扩增之前的细胞含量流式细胞仪检测结果图。 图2(b)是扩增第7天UCB-NKT细胞含量流式细胞仪检测结果图。 图2 (c)是扩增第14天PB-NKT细胞含量细胞含量流式细胞仪检 测结果图。具体实施方式以下列举具体实例进一步阐述本专利技术，应理解，实例并非用于限制 本专利技术的保护范围。实施例1 从脐带血中扩增Va24 NKT细胞1、 脐带血单个核细胞的制备新鲜采集的新生儿脐带和胎盘中的 脐带血以ACD-B抗凝血袋收集，继以体积比4:1加入6。/。HES液中，吹 打均匀后4。C下静置lh，吸取中间白膜层用0.6%ACD-PBS对倍稀释， 混匀后以2:1的比例加入Ficoll上层，离心(2000rpm， 20min)，取中 间细胞环，PBS洗3次，悬浮于含10。/。FCS的完全培养液中。2、 脐带血中Va24 NKT细胞的扩增将新鲜分离的脐带血单个核 细胞接种于12孔细胞培养板中，每实验孔接种密度为5xl0Vml，加入 IL-2 (5U/mL)禾H a-Galcer (100ng/mL)， 37°C、 50/0CO2及饱和湿度的 条件下培养，培养7天后检测V(x24 NKT细胞含量。实施例2从脐带血中扩增Va24 NKT细胞1、脐带血单个核细胞的制备釆集的新生儿脐带和胎盘本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从脐带血中扩增Ｖａ２４ＮＫＴ细胞的方法，包括下列步骤： Ａ．脐带血采集和保存； Ｂ．脐带血单个核细胞纯化； Ｃ．脐带血单个核细胞中Ｖａ２４ＮＫＴ细胞体外扩增。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高峰，
申请(专利权)人：章毅，上海市干细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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