本发明专利技术提供一种高温木聚糖酶和高温α-葡萄糖醛酸苷酶基因及其蛋白表达和应用的方法。高温木聚糖酶基因和高温α-葡萄糖醛酸苷酶基因均来源于热解纤维素菌Caldicellulosiruptor lactoaceticus6A,并在大肠杆菌中得到大量重组表达。高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸苷酶有反应温度高、热稳定性好，pH适应性广等优点。木聚糖酶在80-85℃、pH6.0-8.0时，能有效降解天然木聚糖和木质纤维素，生成低聚木糖,降解率达到80-98%。木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸苷酶能够协同降解天然木聚糖和木质纤维素原料,并产生木二糖、木糖、葡萄糖醛酸。本发明专利技术能够应用于食品、饲料、生物能源等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物质利用领域，具体涉及高温木聚糖酶基因和高温 α-葡萄糖醛酸苷酶基因及其蛋白表达与应用。
技术介绍
： 植物细胞壁是自然界中存在的最主要的可再生资源，在世界能源日益紧缺的情况 下，这些资源越来越受到重视。植物细胞壁主要包括纤维素、半纤维素和木质素。木聚糖是 植物细胞壁中含量仅次于纤维素的多糖，是半纤维素的主要组成成分，并以数量多、组分易 提取等特征成为最具潜力的可再生资源。木聚糖是由吡喃木糖以β-l，4_糖苷键连接而成 杂合高聚物，聚合度为150-200 (Scheller，H.V.，P.Ulvsk〇V.2010)。来源不同的木聚糖具 有不同的侧链取代基，如葡萄糖醛酸残基、乙酰基、阿拉伯糖等，这些长短不同的取代基所 组成的侧链往往是木聚糖降解的限速因素（Dodd, D.，I. K. Cann. 2009)。 事实上，自然界存在的木聚糖结构复杂，含有大量的侧链取代基，其完全水解需要 多种酶组成的木聚糖降解酶系统协同作用才能完成。木聚糖酶（β-l，4-endo_xylanase， EC3. 2. I. 8)存在于第5、7、8、10、11和43糖苷水解酶家族，是降解木聚糖主链的关键 酶。它能以内切方式随机切割木聚糖主链骨架的β-1，4-糖苷键，从而产生不同长度的 低聚木糖和少量的木糖或带有不同分支侧链的木寡糖，使木聚糖聚合度降低（Dodd，D.，I. K. Cann. 2009)。目前许多研究致力于开发更适合工业应用的木聚糖酶，如工程菌的构建、高 产菌株的选育、耐高温、耐酸碱木聚糖酶的发掘等（Juturu，V.，J. C. mi. 2012)。高温木聚糖 酶因其在高温下的高水解活性以及较好的热稳定性在造纸、饲料、食品、医药和能源等领域 均有广泛的应用（Collins, T.，C. Gerday, et al. 2005)。 α -葡萄糖醒酸苷酶（a -glucuronidase,EC3. 2. L 139)来源于糖苷水解酶家族4 和67,能水解4-0-甲基葡萄糖醛酸（4-0-MelGlcA)与木聚糖主链上木糖残基之间的α-1， 2-糖苷键（Yeoman，C.J.，Y. Han，et al. 2010)。当木聚糖酶与木聚糖底物结合时，侧枝的 4-0-甲基葡萄糖醛酸会对木聚糖酶的作用产生空间位阻，使得木聚糖酶不能结合和分解临 近侧枝的木聚糖从而降低木聚糖酶的水解效率。有研究证实，α-葡萄糖醛酸苷酶和木聚 糖酶同时存在时会协同作用提高木聚糖的水溶性，加速低聚木糖的产生（Yeoman，C. J.，Υ. Han, et al. 2010)。同时α-葡萄糖醒酸苷酶能进一步释放被木聚糖酶水解产生的木寡糖 上的4-0-甲基葡萄糖醒酸，使其能进一步被β -木糖苷酶（β -xylosidase，EC3. 2. 1. 37) 彻底水解（Yeoman，C. J.，Y. Han，et al. 2010)。因此α -葡萄糖醛酸苷酶是木聚糖降解酶系 中非常重要的一员，它的生物技术潜力越来越受到人们的关注。 木聚糖的水解产物一低聚木糖是由2-7个木糖以β-1，4_糖苷键连接而成的功 能性低聚糖。低聚木糖具有优良的生理功能，能显著增殖肠道双歧杆菌，抑制肠道有害细 菌，改善肠道菌群（Menezes, C. R. d.，L. R. Durrant. 2008)。低聚木糖能促进人体对钙的吸 收，改善糖尿病症状，抗龋齿，是理想的甜味剂，因此在食品、饲料、医药和农业领域具有广 阔的应用前景（Vazquez, M.，J· Alonso, et al. 2000)。目前低聚木糖的大规模生产主要以富 含木聚糖的天然木质纤维素类生物质(如秸杆、玉米芯等）为原料，采用化学法或酶解法制 备而成。我国是一个农业大国，秸杆、玉米芯、甘蔗渣和红薯渣等农业废弃物富含木聚糖，虽 数量庞大，但生物转化率低。借助基因工程技术生产高效木聚糖酶制剂，降低环境污染，提 高天然木聚糖的生物转化和农业产品品质成为解决问题的关键。 热解纤维素菌Caldicellulosiruptorlactoaceticus 6A是从冰岛喊性热泉 中分离得到的严格厌氧的革兰氏阳性菌，生长温度为50-78°C，最适温度为68°C，耐受 ρΗ5· 8-8. 2，最适 pH 接近 7. 0 (Mladenovska, Z.，I. M. Mathrani, et al. 1995)。其能够 分解和利用纤维素、果胶、淀粉和木聚糖，分泌的高温酶类具有非常可观的工业应用前景 (Mladenovska, Z.，I. M. Mathrani, et al. 1995)。但该菌产生的木聚糖降解酶系组分复杂， 分离纯化困难，加之其生长条件苛刻，生长密度低，不适合工业化大规模生产。因此采用基 因工程技术将此类嗜热微生物的重要糖苷水解酶基因进行异源高效表达一直是研究的热 点。本专利技术以pET-28b为表达载体，以Escherichia coli BL21 (DE3)为宿主菌构建了 C. Iactoaceticus木聚糖酶基因 XynlOA和α-葡萄糖醛酸苷酶基因 XynlOA重组工程菌，成 功实现了木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的高效表达，该项专利技术将为今后 工业化利用该高温木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A降解天然木聚糖和木质 纤维素原料奠定基础。
技术实现思路
专利技术目的： 本专利技术的目的是弥补现有天然木聚糖酶解工艺效率低，以及木聚糖酶制剂活性 低、产量少、稳定性差等问题，提供一种高温木聚糖酶基因 XynlOA和一种α -葡萄糖醛酸苷 酶Agu67A及其重组载体和重组工程菌，以及这两种酶的表达方法和应用。包括： 1.本专利技术提供一种来源于热解纤维素菌Caldicellulosiruptor Iactoaceticus 6A的高温木聚糖酶XynlOA，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。 2.本专利技术还提供一种来源于C. Iactoaceticus 6A的高温α -葡萄糖醒酸苷酶 Agu67A，其基因序列如SEQ ID NO: 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。 3.本专利技术提供包含上述木聚糖酶基因的重组载体pET-28b-XynlOA和包含上述 α -葡萄糖醛酸苷酶基因的重组载体pET-28b-Agu67A。 4.本专利技术提供包含上述木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的重组 菌，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)。 5.本专利技术提供制备上述木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶Agu67A的方法。 6.本专利技术提供上述高温木聚糖酶XynlOA和α -葡萄糖醒酸苷酶Agu67A在酶解天 然木聚糖和木质纤维素原料上的协同应用，优选其在水解榉桦木木聚糖及其在制备低聚木 糖中的应用。 技术方案： 为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案： (1)上述高温木聚糖酶基因 XynlOA和α -葡萄糖醛酸苷酶基因 Agu67A工程菌的 构建 提取热解纤维素菌Caldicellulosiruptor lactoaceticus 6A的基因组本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高温木聚糖酶基因Xyn10A，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩业君，贾晓静，彭小伟，米朔甫，乔玮博，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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