羊驼毛成分的实时荧光PCR检测方法技术

本发明专利技术属于羽绒制品中动物源性成分的定性检测技术，具体地说是检测纤维制品中羊驼成分的引物/探针组。本发明专利技术选取羊驼毛的线粒COXⅠ基因序列，设计一组特异性引物和探针。使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可快速、灵敏、特异地检测纤维制品中的羊驼成分。该引物和探针也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。该法操作简便、重复性好。

【技术实现步骤摘要】
羊驼毛成分的实时荧光PCR检测方法
本专利技术涉及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体讲是涉及一种羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针。
技术介绍
羊驼的英文名是Alpaca，是骆驼科动物的一种，其祖先是驮马。羊驼浑身是宝，其产生的羊驼毛纤维是世界上著名的高级动物纤维之一，以其奢华的手感和光泽著称。由于羊驼毛纤维含有髓腔，其保温性优于其他纤维，具有抗皱性、耐磨性、保湿性等优良特性。用它制成的时装轻柔暖和，穿着舒适，悬垂性好，色彩鲜艳，阳光照射下还发出五彩光，颇受消费者的喜爱，成为继羊绒之后又一种高档特种动物纤维产品。鉴别羊驼毛一般采用显微镜法，微观结构法和扫描电镜法等。但这些方法都存在一定的不足，甚至某些情况下无法准确鉴别。自1975年Bradfied等成功地从头发中提取DNA以来，发毛已成为法医学、遗传学常用的检测材料之一。近年来，DNA法鉴别动物纤维的报道常见于各类报纸杂志，该方法的关键是DNA的提取，提取成功与否决定了能否鉴别纤维。有关毛干DNA提取及检测的报道已屡见不鲜，但关于羊驼毛DNA提取及检测方面的报道较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对羊驼毛线粒体COXI基因序列，设计一组特异性引物和探针，进而建立一种快速检测羊驼毛DNA方法，以克服传统的显微镜法难以准确判定的局限性，为羊驼毛成分检测提供有效工具，以期与传统鉴别方法相结合，提高羊驼毛鉴别的客观性和准确度。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针：上游引物：5’-GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3’下游引物：5’-ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3’探针：5’-CAACATTAAATGATCCCCCG-3’。所述探针为TaqMan探针，其5’端标记有报告荧光集团，3’端有淬灭荧光集团。所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物：下游引物：探针＝1：1：1；其检测过程如下：(1)待检样品DNA的提取采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒提取羊驼毛的DNA。(2)羊驼毛成分的实时荧光PCR扩增A.在反应管中加入PremixExTaq(2×)12.5μL，PrimerF(10μM)1μL，PrimerR(10μM)1μL，Probe(5μM)1μL，DNA*2μL，dH2O7.5μL，Total25μL。B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：95℃30sec，1个循环，95℃5sec，60℃30sec，40个循环，PCR扩增。Negativecontrol反应时，加入RNasefreedH2O；Positive反应时，做2个平行样。(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果反应结束后，设置无效基线范围；基线范围选择在3～15个循环，如果有强阳性样本，根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准，设置阈值后，分析样品的检测结果。待测样品羊驼毛成分检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出羊驼毛成分。待测样品羊驼成毛分检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出羊驼毛成分。待测样品羊驼毛成分检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出羊驼毛成分；再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出羊驼毛成分。本专利技术采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的纤维制品中羊驼毛成分的检测。附图说明图1PCR特异性检测结果；图2羊驼毛DNA荧光PCR结果；图3荧光PCR灵敏度检测结果；图4重复性PCR结果；图5重复性荧光PCR结果；图6重复性荧光PCR结果；图7重复性荧光PCR结果。具体实施方式具体结合实施例对本专利技术做进一步说明。羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针：上游引物：5’-GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3’下游引物：5’-ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3’探针：5’-(FAM)CAACATTAAATGATCCCCCG(Eclipse)-3’。所述探针为TaqMan探针，其5’端标记有报告荧光集团，3’端有淬灭荧光集团。所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物：下游引物：探针＝1：1：1。实施例11、从纤维制品的不用部位取样，共取约1g试样；用剪刀将样品剪碎，经分析研磨机打散混匀，再用剪刀尽量剪碎至2mm以下，再次用分析研磨机混匀；2、从混匀的样品中称取约5mg试样，放入2mL离心管中，每个试样平行提取2管，加入180μL的缓冲液GL(BufferGL)、20μL的蛋白酶K(ProteinaseK)和10μL的核糖核酸酶A(RNaseA，10mg/mL)，于56℃水浴温浴至组织完全裂解3小时；如残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先12,000rpm离心2分钟，去除杂质之后再进行后续操作。向裂解液中加入200μL缓冲液GB(BufferGB)和200μL100％乙醇，充分吸打混匀。温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。将离心管(SpinColumn)安置于收集管(CollectionTube)上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。将500μL的缓冲液WA(BufferWA)加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。将700μL的缓冲液WB(BufferWB)加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。确认BufferWB中已经加入了指定体积的100％乙醇。沿SpinColumn管壁四周加入BufferWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。然后重复上述加缓冲液WB操作步骤一次。将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50μL的灭菌水或洗脱液(ElutionBuffer)，室温静置5分钟。将灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50μL的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。以上操作中的BufferGL、BufferWA、BufferWB以及Spincolumn、CollectionTube均来自宝生物工程(大连)有限公司TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0试剂盒。3、PCR反应体系在优化好的PCR反应条件和反应体系下，以鸭绒、鹅绒、绵羊毛、兔毛、山羊绒、毛牛绒、羊驼毛的DNA为特异性试本文档来自技高网...

【技术保护点】
羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针，其特征在于：上游引物：5’‑GCTTATTTTACATCCGCCACAA‑3’下游引物：5’‑ACCTCCTACGGTGAACAGGAA‑3’探针：5’‑CAACATTAAATGATCCCCCG‑3’。

【技术特征摘要】
1.羊驼毛成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：上游引物：5’-GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3’下游引物：5’-ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3’探针：5’-CAACATTAAATGATCCCCCG-3’；所述探针为TaqMan探针，其5’端标记有报告荧光基团，3’端有淬灭荧光基团；所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物：下游引物：探针=1：1：1；其检测过程如下：（1）待检样品DNA的提取采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒提取羊驼毛的DNA；（2）羊驼毛成分的实时荧光PCR扩增A．在反应管中加入PremixExTaq2×12.5μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，5μM探针1μL，DNA2μL，dH2O7.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玫，任亮，孔平，杨春光，颜怀玉，肇慧君，李晶泉，张浩，
申请(专利权)人：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局，宝生物工程大连有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21