一种榆树枯萎病菌的分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种榆树枯萎病菌的分子检测方法，以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B进行巢式PCR的第一轮反应，以第一轮反应产物为模板，以引物OpF和引物OpR为特异性引物，进行巢式PCR的第二轮反应，反应产物进行电泳检测，电泳图中出现304bp条带即为检测出榆树枯萎病菌，否则未检出；其中，引物OpF序列为：5'-GCCCGCCACTGGTTTTGA-3'；引物OpR序列为：5'-CCGCCCGAACCTTTTCCA-3'。该方法为榆树枯萎病菌的检测和评估提供一种准确、快速的途径，引物OpF和引物OpR具有很强的特异性，本方法的检测灵敏度能够达到常规PCR的10倍。

【技术实现步骤摘要】
一种榆树枯萎病菌的分子检测方法
本专利技术属于森林保护学的分子检测
，具体涉及一种榆树枯萎病菌（Ophiostomaulmi(Buisman)Nannf.）的分子检测方法。
技术介绍
榆树枯萎病是最具毁灭性的植物病害之一，最早报道于比利时和瑞士，大约在1881~1921年西北欧的比利时、法国、荷兰等国相继发生这种病害，到1930年已传遍了意大利和保加利亚。在上世纪30年代和70年代该病发生了两次大的爆发性流行，迅速传遍了欧洲、北美和中亚30多个国家和地区，对这些地区的榆树造成了毁灭性的破坏，带来巨大经济、生态损失。我国疆土辽阔，榆树资源丰富，广泛分布于我国南北带，据不完全统计共有：白榆、黑榆、黄榆、椿榆、榔榆等19个种、2个变种、6个栽培种和一些新的栽培变种。榆树因其生长迅速、繁殖力强、适应性广，不仅是我国是城乡绿化的优良树种，还是我国防护林、生态林、用材林和风景林的主要树种之一，对我国城乡绿化、可再生资源利用和生态环境建设起着举足轻重的作用。榆树枯萎病菌主要为害榆属树种，一旦传入我国，将会给我国的榆树种造成非常大的损失。现已列入我国检疫性有害生物名录。目前，世界上对于榆树枯萎病菌的分子检测方法报道的较少，Witthuhn等建立了PCR-RFLP技术来区分长喙壳属一些重要种的系统发育关系，但是该方法成本高，过程复杂，检测灵敏度低，难以定量，且对于样品DNA的纯度要求比较高，故不适宜在各检疫口岸推广和应用。所以，急需对其建立一套快速、准确的检测方法，以避免该病原菌入境后所造成的难以弥补的经济损失。目前，可以通过组织分离后形态学观察以及分子生物学检测鉴定方法病检测原菌。但前者存在着分离难度大，周期长，不准确等缺点，近年来，越来越多的研究者采用分子生物学的方法来检测林木病原菌。如利用细胞核内或线粒体内rDNA为检测位点的PCR技术在真菌鉴定的不同分类水平上都有着广泛的应用。现阶段针对榆树枯萎病菌亟须建立一套快速、准确、可靠的分子检测方法，能够快速检测入境木材中所携带的病原菌，以防造成国内不必要的损失。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种榆树枯萎病菌的分子检测方法，以期为榆树枯萎病菌的检测提供一种准确、快速的途径。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种榆树枯萎病菌的分子检测方法：以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B进行巢式PCR的第一轮反应，以第一轮反应产物为模板，以引物OpF和引物OpR为特异性引物，进行巢式PCR的第二轮反应，反应产物进行电泳检测，电泳图中出现304bp条带即为检测出榆树枯萎病菌，否则未检出；其中，引物OpF序列为：5'-GCCCGCCACTGGTTTTGA-3'；引物OpR序列为：5'-CCGCCCGAACCTTTTCCA-3'。所述的榆树枯萎病菌的分子检测方法，具体步骤如下：（1）取0.5g冷冻过的菌丝，放于2mL的平底离心管内，加入2颗直径为3mm钢珠，关上管盖置于研磨仪上，30f/min，研磨3min，取出钢珠，加入500μLCTAB，于液氮内冷冻2min，再放于75℃水浴锅内融化2分钟，重复两次，最后一次于75℃水浴锅内融化30min，接着加入500μL的25:24:1的酚：氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2倍体积的预冷无水乙醇沉淀1h，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，自然风干，50μLddH2O溶解DNA，-20℃保存备用；（2）巢式PCR反应，巢式PCR第一轮PCR反应的引物为通用引物ITS1-F/ITS4-B，PCR反应总体积为25µL，包含1µL基因组DNA，10µM的上下游引物各1µL，2.5µL10×PCRbuffer，2µL25mM的MgCl2，2.5µLdNTP，1.25UTaqDNA聚合酶，14.75µLddH2O；PCR反应程序为：预扩增95℃180s，接着94℃30s，58℃30s，72℃60s，30个循环，最后在72℃延伸10min；巢式PCR第二轮反应以特异性引物OpF/OpR为引物，巢式PCR第一轮PCR产物稀释50倍，取2uL作为第二轮反应模板，PCR反应体系与第一轮相同，PCR反应条件为：预扩增95℃180s，接着94℃30s，58℃30s，72℃60s，30个循环，最后在72℃延伸10min；（3）取巢式PCR产物进行琼脂凝胶电泳检测，电泳图中出现304bp条带即为检测出榆树枯萎病菌。步骤（1）中，在进行菌丝DNA提取时，当DNA溶于100uLTE溶液后，再次加入200uLCTAB重复提取一次。本专利技术利用真菌通用引物ITS1-F/ITS4-B扩增了榆树枯萎病菌的核糖体DNA内转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较，设计了一对榆树枯萎病菌引物OpF/OpR，将所设计的特异性引物放回GeneBank中的Primer-Blast比对，并用该对引物对所有供试菌株进行巢式PCR扩增以验证所设计引物的特异性。巢式PCR是基于内部引物，进行两轮PCR扩增，能增加DNA扩增片段的浓度，对PCR抑制物质起到稀释作用，因此可以避免低DNA浓度和PCR抑制化合物对检测的影响。有益效果：本专利技术以待测样品DNA为模板，以引物OpF和引物OpR为特异性引物，进行巢式PCR反应，产物进行电泳检测后即可以快速检测榆树枯萎病菌。该方法为榆树枯萎病菌的检测和评估提供一种准确、快速的途径，引物OpF和引物OpR具有很强的特异性，本方法的检测灵敏度能够达到常规PCR的10倍。附图说明图1是特异性引物OpF和引物OpR常规PCR扩增榆树枯萎病菌的DNA灵敏度检测的1.2%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，100v，57mA，电泳30min；图中，泳道M为DL2000DNAMarker；泳道1~4为榆树枯萎病菌菌株DNA；泳道5~8为长喙壳菌(Ceratocystissensulato)DNA；泳道9~10为甘薯长喙壳菌（Ceratocystissensulato）DNA；泳道11为双蒸水；图2是特异性引物OpF∕OpR巢式PCR扩增榆树枯萎病菌的DNA灵敏度检测的1.2%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，100v，57mA，电泳30min；图中，泳道M为DL2000DNAMarker；泳道1~10为20uLPCR反应体系中分别含DNA模板1pg，泳道11为双蒸水；图3是将分离获得的菌落形态特征与榆树枯萎病菌培养性状类似的分离物利用特异性引物OpF和引物OpR常规PCR检测的1.2%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，100v，57mA，电泳30min；图中，泳道M为DL2000DNAMarker；泳道1为榆树枯萎病菌阳性对照；泳道2为分离纯化榆树枯萎病菌DNA；泳道3为分离病原菌混合DNA；泳道4为双蒸水；图4是榆树枯萎病菌特异性引物OpF和引物OpR巢式PCR反应分析的1.2%琼脂凝胶电泳图；其中，电泳条件，100v，57mA，电泳30min；图中，泳道M为DL2000DNAMarker；泳道1~4为榆树枯萎病菌菌株DNA；泳道5~8为长喙壳菌(Ceratocystissensulato)DNA；泳道9~10为甘薯长喙壳菌（Ce本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种榆树枯萎病菌的分子检测方法，其特征在于：以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1‑F/ITS4‑B进行巢式PCR的第一轮反应，以第一轮反应产物为模板，以引物OpF和引物OpR为特异性引物，进行巢式PCR的第二轮反应，反应产物进行电泳检测，电泳图中出现304bp条带即为检测出榆树枯萎病菌，否则未检出；其中，引物OpF序列为：5'‑GCCCGCCACTGGTTTTGA‑3'；引物OpR序列为：5'‑CCGCCCGAACCTTTTCCA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种榆树枯萎病菌的分子检测方法，其特征在于：以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B进行巢式PCR的第一轮反应，以第一轮反应产物为模板，以引物OpF和引物OpR为特异性引物，进行巢式PCR的第二轮反应，反应产物进行电泳检测，电泳图中出现304bp条带即为检测出榆树枯萎病菌，否则未检出；其中，引物OpF序列为：5'-GCCCGCCACTGGTTTTGA-3'；引物OpR序列为：5'-CCGCCCGAACCTTTTCCA-3'；ITS1-F的序列为：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，ITS4-B的序列为：5'-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3'。2.根据权利要求1所述的榆树枯萎病菌的分子检测方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）取0.5g冷冻过的菌丝，放于2mL的平底离心管内，加入2颗直径为3mm钢珠，关上管盖置于研磨仪上，30f/min，研磨3min，取出钢珠，加入500μLCTAB，于液氮内冷冻2min，再放于75℃水浴锅内融化2分钟，重复两次，最后一次于75℃水浴锅内融化30min，接着加入500μL的25:24:1的酚：氯仿：异戊醇，...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建仁，陶兆雪，王焱，张培，吴小芹，周爱东，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32