本发明专利技术涉及一种番茄红素在制备人精液冷冻保护剂中的应用，属于人精液冷冻保护剂领域。番茄红素在制备人精液冷冻保护剂中的应用。含番茄红素的每100mL人精液冷冻保护剂中含有下列物质：葡萄糖1.5g，柠檬酸三钠二水1.3g，甘油20ml，番茄红素4.296×10‐4g‐4.296×10‐3g，卵黄20ml，二甲基亚砜0.01mL‐0.1mL，余量为双蒸水。本发明专利技术加入一定量的番茄红素，对人精子冷冻效果有明显改善，复苏后的人精子功能学参数：前向活动率、存活率显著高于对照组(未添加番茄红素)，且正常形态率、DNA完整率和线粒体膜电位也明显高于对照组，而精子凋亡率显著低于对照组，从而提示对人精子质量保护更具有良好的安全性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于人精液冷冻保护剂领域。
技术介绍
精子是带有遗传物质的特殊细胞。精液经过技术处理，在冷冻保护剂的保护下，经 过一定的降温程序，保存在超低温状态下（液氮中），精子呈现玻璃样的冻结，不会出现原 生质脱水，其本来结构受到保护，所以解冻后的精子仍能复苏，恢复活力。冷冻状态的精子 代谢活动受到明显抑制，其生命处于静止状态，从而达到能长期保存的目的。 精子冷冻保护剂是精子冷冻技术的最重要物质。目前最常用的精子冷冻保存 剂是含甘油和卵黄的复合型冷冻液，由甘油、卵黄、葡萄糖、枸橼酸钠等组成。冷冻保护 剂根据作用机理分为渗透性冷冻保护和非渗透性冷冻保护，甘油属于渗透性冷冻保护 剂，非渗透性冷冻保护剂有果糖、蔗糖、卵黄、白蛋白等。渗透性冷冻保护剂渗入细胞内， 降低细胞内外渗透压的差，当细胞外冻结时，减轻细胞皱缩的程度和速度；还能与细胞 内水分及电解质结合，导致水合结构蛋白的稳定，发挥抗冻作用。非渗透性冷冻保护剂 不能进入细胞，通过维持细胞膜的稳定起保护作用，冷冻时促进细胞内水分外溢，细胞 发生皱缩，从而减少细胞内的冰晶形成。研宄表明，在精液冻融过程中产生大量活性氧 〇^8(：1：；[￥6(?786118口6(^68，1?05)，精子质膜的脂类含量约占50%以上。而精子质膜因为富 含多聚不饱和脂肪酸（poly-unsaturatedfattyacid，PUFA)，其中，脂质的主要成分为磷脂 和胆固醇。细胞膜是由脂类构成的双分子层结构，膜脂类具有亲水和疏水的两部分，为脂肪 酸。脂肪酸易受ROS损伤，从而导致冻融后精子运动参数明显下降。活性氧对精子的损伤 随着氧化应激对精子所产生影响的深入研宄，发现活性氧对精子产生各个层面的影响，主 要有以下几个方面。 ①精子膜损伤：目前大量研宄表明精子膜中含有大量的多不饱和脂肪酸极易受到 ROS的攻击。因此活性氧引起膜多不饱和脂肪酸减少造成精子的流动性和通透性发生改变， 导致精子的运动性和完整性发生不可逆的损伤。与此同时，活性氧也会造成线粒体膜的损 伤，使线粒体的呼吸功能发生改变，精子线粒体产生的能量减少，精子的运动能力降低。 ②DNA损伤：DNA作为遗传物质的传递者，其损伤直接影响精子质量以及受精卵的 产生。氧化应激会通过自由基的产生引起精子DNA发生单链或双链的断裂，同时也由于线 粒体DNA是裸露的DNA，缺少蛋白质的保护和本身修复损伤能力较弱。常常导致精子直接损 伤，此外。活性氧及其代谢产物也会对细胞产生毒性，引起细胞凋亡，直接造成精子损伤。 ③蛋白质损伤：由于活性氧可以诱导蛋白质硫醇基过氧化会使精子的功能和结构 发生改变，使精子更容易受到损伤，此外大量活性氧的产生还可引起顶体结构的损伤，从而 降低精子的受精能力。此外，精子体外培养以及ART中精子的冷冻保护都会影响精子的功 能和结构的变化，造成精子膜脂质过氧化、DNA和线粒体损伤等一系列变化。 番茄红素lycopene是开链式的不饱和类胡萝卜素，属类胡萝卜素中的胡萝卜素 类（只有碳氢元素组成），在类胡萝卜素中表现出较强的抗氧化性具有清除自由基、促进细 胞间隙连接通讯、防癌抑癌等多种生理功能，其特有的功能与性质为世人所关注，引发了世 界性的对番茄红素生产技术及其功效的研宄热潮。番茄红素已被证明是非常有效的单线态 氧猝灭剂，同时也对氮氧自由基（NO)，磺酰基（RSO2)等自由基有消除作用。 番茄红素是在西红柿中天然存在的类胡萝卜素的一种，而类胡萝卜素是人体抗氧 化防御系统中重要的组成成分，其在内分泌等系统中扮演越来越重要的角色。在类胡萝卜 素中，番茄红素不仅是常见也是能够在水果和食物中经常食用到的，它在能够最有效的清 除单线态，同时也能够清除过氧自由基。
技术实现思路
本专利技术提供一种，以解决目前常用的 含甘油和卵黄的精子复合型冷冻液存在的如下问题：冷冻复苏精子前向运动率低、复苏率 低、正常形态率低、DNA完整率低、凋亡率高。 本专利技术采取的技术方案是：。 番茄红素在制备能提高冷冻复苏精子前向运动率的人精液冷冻保护剂中的应用。 番茄红素在制备能提高冷冻复苏精子复苏率的人精液冷冻保护剂中的应用。 番茄红素在制备能提高冷冻复苏精子正常形态率的人精液冷冻保护剂中的应用。 番茄红素在制备能提高冷冻复苏精子DNA完整率的人精液冷冻保护剂中的应用。 番茄红素在制备能降低冷冻复苏精子凋亡率的人精液冷冻保护剂中的应用。 含番茄红素的每IOOmL人精液冷冻保护剂中含有下列物质： 葡萄糖1.5g，柠檬酸三钠二水1.3g，甘油20ml，番茄红素 4.296\1〇-\-4.296\1〇-4，卵黄2〇1111，二甲基亚砜0.011^-〇.11^，余量为双蒸水。 所述番茄红素的人精液冷冻保护剂的制备方法包括下列步骤： (一）99. 9mL-99. 99mL卵黄、甘油复合型冷冻保护剂的制备 (1)称量I. 5g葡萄糖和I. 3g梓檬酸三钠二水，加双蒸水至59. 9mL_59. 99mL; (2)加入20mL甘油后完全混匀，完全溶解后用0. 45ym微孔滤器过滤； (3)加入20mL新鲜卵黄，制成悬浮液；(4)将所制成的悬浮液置56°C水浴中30分钟，震荡搅拌； (5)检测溶液的pH值，使pH值在6. 8-7. 2之间；(6)溶液送细菌培养，要求无菌； (7)冷藏保存；(二）添加番茄红素 (1)将卵黄、甘油复合型冷冻保护剂37°C水浴解冻； (2)番茄红素从冰箱内取出，分别取番茄红素4. 296X10_4g-4. 296X10、融入 0.OlmL-O.ImL二甲基亚砜中，制成番茄红素含量为80mmol/L的溶液， (3)取0.OlmL-O.ImL上述溶液加入到99. 9mL-99. 99mL的卵黄、甘油复合型冷冻保 护剂中，其中番茄红素浓度为8ymol/L?80ymol/L〇 采用含番茄红素的人精液冷冻保护剂的人精液冷冻方法，包括下列步骤： (一）7°C水浴解冻含番茄红素的人精液冷冻保护剂；(二）取1份体积的含番茄红素的人精液冷冻保护剂加入到3份体积精液中，逐滴 加入同时旋转试管； (三）加入冷冻保护剂后，混合液分装在精子冷冻管，使用Therm〇7451程控降温仪 冷冻，设定冷冻程序如下： (1)20°C平衡5分钟；(2)从20°C降至_2°C，冷冻速率_1°C /min ;(3)从-2°C降至-30°C，冷冻速率-7. 2°C/min;(4)从-30°C降至_90°C，冷冻速率_30°C /min。 本专利技术具有如下优点：番茄红素是脂溶性抗氧化物质，直接添加入水溶性保护剂 中，并不能形成均一稳定的保护剂溶液。因此，我们选择能够溶解番茄红素并能够和水溶性 保护剂互溶的有机溶剂作为中间介质，使番茄红素能够溶于水溶性保护剂，达到更好的保 护作用。减少精子冻融过程中产生大量活性氧对精子的损伤，因此冷冻保护液中添加抗氧 化物质：番茄红素，并采用一种中间介质更好的对抗活性氧对精子的损伤，维持精子的正常 形态和功能。目前，还未有报道采取此种措施将番茄红素用于人精液冷冻保护剂中。 在精液冷冻保护液中添加一定浓度的番茄红素可以减少线粒体氧化损伤，减轻 ROS对精子质I旲的氧化应激性损伤，从而提尚精子的抗调亡能力。提尚冷冻精液的复苏率， 活率，前向运动精本文档来自技高网...
【技术保护点】
番茄红素在制备人精液冷冻保护剂中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁作文，王洪亮，李付彪，刘凌云，郭凯敏，刘浩，沈娜，戴小凡，徐胜旗，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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