本发明专利技术涉及生物技术低温医学领域，特别涉及一种无DMSO的冷冻保护剂，含有海藻糖200mmol/L，PVP40 0.3g/mL，胆固醇200ug/L，卵磷脂200ug/L。对新采摘卵巢灌注冷冻保护剂；将卵巢表面任何肉眼可见的卵泡穿刺，抽吸去除内容物，然后将卵巢放入冷冻袋中，进行降温。本发明专利技术的冷冻保护剂不含有DMSO，无细胞毒性，易去除，原料易得，制备简单，冷冻保护效果好，正常形态原始卵泡比率高，细胞凋亡数量少；本发明专利技术的冷冻保存卵巢的方法，简单易操作，冷冻保存效果好，对羊卵巢整体冻存后可较好保存组织学形态。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术低温医学领域，特别涉及一种无DMS0的冷冻保护剂，还涉及使用 此冷冻保护剂的冷冻保存卵巢的方法。
技术介绍
随着诊断及治疗手段的进步，生育期女性癌症患者的生存率显著提升。但是，癌症治疗 手段(如放化疗)可能造成卵巢功能下降甚至衰竭。卵巢皮质组织深低温冻存现已作为放化 疗前保存生育力的方法应用于临床，但受限于移植后组织缺血损伤以及大量卵泡损失，而 完整卵巢移植通过吻合血管可恢复血供，理论上能够克服这个难题，现已有羊完整卵巢冻 融后移植并分娩小羊的报道。 完整卵巢冷冻与皮质冷冻相似，常采用二甲基亚砜（DMS0)、甘油、动物血清等冷 冻保护剂，但冷冻保护剂的渗透及去除较皮质块更困难，特别是DMS0,在4°C以上具有细胞 毒性。因此，研究一种无毒且细胞存活率高的冷冻保护剂，就成为卵巢冷冻领域亟待解决的 一个问题。海藻糖具有无毒性及保存细胞活性，已成为近年冷冻保护剂领域研究热点。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中冷冻保护剂有毒性、渗透及去除困难的问题，本专利技术公开了 一种不含DMS0的无毒、易去除、能较好保存组织学形态的无DMS0的冷冻保护剂。 本专利技术还提供了使用上述无DMS0的冷冻保护剂冷冻保存卵巢的方法。 本专利技术是通过以下步骤得到的： 一种无DMS0的冷冻保护剂，含有以下组分： 海藻糖 200mmol/l，PVP40 0? 3g/mL，胆固醇 200ug/l，卵磷脂 200ug/l。 所述的冷冻保护剂，还含有胎牛血清0. lg/mL和RMPI-1640。 所述的冷冻保护剂，将海藻糖、PVP40、胆固醇、卵磷脂、胎牛血清（FBS )、RMPI-1640 混合制成无菌悬池液。 -种冷冻保存卵巢的方法，包括以下步骤： (1) 灌注：对新采摘卵巢，通过卵巢动脉插管并行丝线固定，结扎卵巢动脉分支后，与灌 注装置相连，启动装置以〇. 5-5mL/min的速率，向卵巢灌注权利要求1-3中任一项所述的冷 冻保护剂，灌注时长共计10_60min ; (2) 冻存：灌注后，将卵巢表面任何肉眼可见的卵泡穿刺，抽吸去除内容物，然后将卵 巢放入装有相应权利要求1-3中任一项所述的冷冻保护液的冷冻袋中，进行降温，设定为 ①4°C平衡，②以1°C /min的速度降至0°C，并保持lOmin，③以2°C /min的速度降至-18°C， 保持15min，④以2°C /min速度降至-45°C，保持15min，⑤再以5°C /min的速度降至-90°C， 保持5min，随后投入液氮中存放。 所述的方法，步骤（1)中灌注速率为1. 3mL/min，灌注时长30min。 所述的方法，所述卵巢为羊卵巢。 本专利技术的有益效果： 1) 本专利技术的冷冻保护剂不含有DMS0,无细胞毒性，易去除，原料易得，制备简单，冷冻保 护效果好，正常形态原始卵泡比率高，细胞凋亡数量少； 2) 本专利技术的冷冻保存卵巢的方法，简单易操作，冷冻保存效果好，对羊卵巢整体冻存后 可较好保存组织学形态。【附图说明】 图1冻融后羊卵巢皮质区内典型的正常形态及异常形态的原始卵泡， (A)(―处）示正常形态原始卵泡，球形卵母细胞，细胞核完整且核仁清晰，周围被均匀 分布的颗粒细胞包绕。Bar=100ym(B)(―处）示异常形态卵泡，胞浆内含有空泡（丨处)， 周围颗粒细胞排列紊乱，Bar=100ym.; 图2 (A)光镜下各组羊卵巢髓质区域代表性图片（HE染色)Bar=100iim，（B)各组基 质细胞图像计数量化分析$表示与新鲜对照组比较代0.05 ; 图3 (A)各组TUNEL反应阳性的细胞代表性图片，蓝色为细胞核被DAPI染色，绿色为 凋亡细胞被TUNEL标记显色，Bar=100ym; (B)各组TUNEL反应阳性的细胞图像量化分析* 表示与新鲜对照组比较代〇.05,A表示与海藻糖组比较K0. 05 ; 图4 BAX基因和CIRP基因mRNA在各组中的表达。【具体实施方式】 以下通过实施例对本专利技术的配方原理及制备方法做进一步的说明。下述实施例以 羊卵巢为例。 实施例1冷冻保护剂配方的筛选 细胞形态的完整，或者说细胞膜性结构的完整度，是保证细胞活性和功能的基础。人脐 血MNC在冷冻、干燥与复水实验过程中，细胞膜性结构会因物质相变原因必然不同程度受 到溶质、冰晶损伤。DMS0、海藻糖、PVP等细胞冷冻保护剂可以降低溶质、冰晶损伤幅度，从 而保护细胞膜型结构。我实验组前期实验总结，猜测细胞膜型结构的流行性会对冷冻、干燥 和复水过程中的细胞活性有一定影响。鉴于此，来对冷冻保护剂的配方进行筛选。 实验试剂： Ficoll，海藻糖，PVP，胆固醇，卵磷脂，台盼蓝，细胞凋亡检测Annexin VPI双染色法试 剂盒 实验步骤： 一、脐血提取 1、采用内含28mL柠檬酸钠抗凝剂的200mL双联脐带血收集袋收集新生儿脐血。 2、Ficoll 离心分离： a、取脐血分装至50mL离心管，2200rpm离心15min， b、 取中间白膜层，即白细胞层，按照1:2体积比例与生理盐水混合， c、 按照体积比1:1比例，加注到准备好的淋巴细胞分离液的50mL离心管中，保持界面， d、 2200rpm离心20min，无刹车停止，保证各种层面界限， e、 留取白膜层，生理盐水清洗2遍，得到脐血MNC。 二、实验分组： 各组中每100mL冷冻保护剂中分别含有以下组分 1、 200mmol/L 海藻糖 +0? 3g/mL PVP40， 2、 200mmol/L 海藻糖+0.3g/mL PVP40 + 胆固醇 200ug/L， 3、 200mmol/L 海藻糖 +0. 3g/mL PVP40+ 卵磷脂 200ug/L， 4、 200mmol/L 海藻糖+0? 3g/mL PVP40+胆固醇 200ug/L + 卵磷脂 200ug/L， 4、 将留取的MNC，加相同体积的细胞冷冻保护液，吹打混匀，分装至冻存瓶， 5、 细胞冷冻盒冷冻： 4。(：平衡 lOmin ;-2(TC 30min ;-8(TC过夜； 三脐血MNC相关活性检测 流式细胞仪检测：购置细胞凋亡检测试剂盒(双染)，判别检测分析冻存前后的细胞分 裂周期以及细胞存活率。 四、实验结果：复苏实验流式细胞凋亡检测结果 每瓶加培养基3mL离心，在加培养基3mL重旋，结果见表1。 表 1初步结论及分析 实验组冷冻脐血MNC复苏后结果，显示：组别1、2活细胞和正在凋亡细胞比例总和分别 为80. 10%、75. 84%，其中正在凋亡的细胞比例分别为51. 43%、40. 68% ;组3、4活细胞和正在 凋亡细胞比例总和分别为43. 16%、49. 39%，其中正在凋亡的细胞比例分别为5. 76%、4. 42% 。组别3、4细胞凋亡比例显著降低，其机械性至死或者自然坏死细胞比例比较提高，另外组 4活细胞比例较1、2、3组显著提高，由30%段提高到40%段。由此可以推测，卵磷脂有抑制 细胞凋亡的作用（机理暂时不明确，有待进一步实验分析)，胆固醇与卵磷脂联合使用可以 起到保护细胞膜结构的作用。 实施例2 (1)实验动物将28只带有卵巢动脉及主动脉的带血管蒂的羊卵巢作为对象，置于含有 肝素钠和抗生素(终浓度分别为肝素钠〇. 01IU/L，青本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种无DMSO的冷冻保护剂，其特征在于含有以下组分：海藻糖200mmol/L，PVP40 0.3g/mL，胆固醇200ug/L，卵磷脂200ug/L。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：迟令龙，李栋，
申请(专利权)人：山东省齐鲁干细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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