一种红掌脱毒培养的方法技术

本发明专利技术涉及植物组织培养技术领域，为解决红掌脱毒组培苗生产存在的操作难度大、脱毒效率低、生产周期长等问题，本发明专利技术提出一种红掌脱毒培养的方法，外植体准备、诱导培养、增殖培养、变温热处理、分化培养、准脱毒母株诱导培养、准脱毒母株增殖和分化、准脱毒株系生长、病毒检测、脱毒材料增殖分化、脱毒苗壮苗生根，本方法是一种操作简便、脱毒材料获得率高、速度快的红掌种苗脱毒培养方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物组织培养
，具体涉及一种红掌种苗脱毒培养的方法。
技术介绍
红掌(Anthurium andraenum)又称花烛、安祖花,是天南星科花烛属多年生草本植物，在许多热带国家和地区是仅次于热带兰的主要切花品种，同时也是主要的盆栽花卉。在我国红掌产业经历20多年的发展，也已成为主要的盆栽花卉和切花。但随着生产规模的扩大和种植年份的增加，大棚和田间感染病毒的植株比例也在逐年提高。红掌规模生产的种苗绝大部分是组培苗，但国产组培苗大部分不是脱毒苗。脱毒苗生产的关键是脱毒技术，获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和茎尖微嫁接脱毒等方法。普遍采用的是茎尖培养脱毒法，具体的步骤是:切取植物茎尖的顶端分生组织，诱导产生不定芽或愈伤组织，从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株得到脱毒苗。但是这种茎尖分生组织脱毒法存在的问题是:1、要切取很小的茎尖分生组织，需在显微镜下进行，操作难度大，同时容易造成污染；2、切取茎尖越小，成活率越低。3、分生组织体积较常规组培小很多，因此产生较多不定芽或愈伤团块所需时间较常规组培要长得多；4、若切取茎尖偏大，往往不能完全脱除病毒。因此，红掌脱毒组培苗生产存在脱毒材料获得率低、操作费工、生产周期长、脱毒不彻底等问题，脱毒效率低影响了脱毒技术在红掌组培苗生产中的应用。热处理脱毒在红掌脱毒苗生产中也未见应用。申请号为CN201310724001的中国专利，公开了一种山葵脱毒苗的培养方法，申请号为CN201410336067.2的中国专利，公开了一种大薯脱毒组培苗的培养方法，这两个专利都是采用茎尖培养方法进行脱毒的，两种作物的组培都是通过茎尖分生组织诱导不定芽的途径进行。山葵脱毒专利还对茎尖进行了热处理脱毒，但由于植物和病毒的不同难以直接应用于红掌脱毒。
技术实现思路
为解决红掌脱毒组培苗生产存在的操作难度大、脱毒效率低、生产周期长等问题，本专利技术提出，本方法是一种操作简便、脱毒材料获得率高、速度快的红掌种苗脱毒培养方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:，所述脱毒培养的方法为以下步骤:(I)外植体准备:取红掌叶及叶柄，经灭菌处理，作为组培用的外植体；选取红掌新展的嫩叶及叶柄进行灭菌处理，灭菌处理过程为:用流水冲洗30分钟后用70%酒精浸泡0.5?1.0分钟，用无菌水冲洗后再用0.1 %的升汞溶液浸泡8?10分钟，再经无菌水冲洗5?7次。(2)诱导培养:将步骤(I)的外植体切段或切片接种在诱导培养基上，经50?90天诱导出肉眼可见黄色愈伤组织小颗粒；(3)增殖培养:将步骤⑵愈伤组织接种在增殖培养基上，增殖继代若干次；(4)变温热处理:将步骤(3)增殖培养后的愈伤组织先置于38?36°C环境中8?12小时，再置于32?26°C环境中12?16小时，再回到38?36°C环境，如此循环25?35天;(5)分化培养:将经步骤(4)处理成活的愈伤组织接种到分化培养基上分化出苗；(6)准脱毒母株诱导培养:将步骤(5)分化出的苗作为准脱毒母株切去根部，每株单独接种到增殖培养基上；(7)准脱毒母株增殖和分化:将步骤(6)准脱毒母株基部产生的愈伤组织增殖继代，增殖到一定量后将愈伤组织任意分割成两部分，其中一部分增殖继代，另一部分接种到分化培养基上，每株准脱毒母株产生的愈伤组织单独接种并标记，由同一母株愈伤组织分化产生的小植株组成一个株系；(8)准脱毒株系生长:将步骤(7)愈伤组织在分化培养基上分化出的小植株按株系分别转接到壮苗生根培养基培养；(9)病毒检测:当步骤(8)的株系植株生长达到病毒检测所需的生长量时，对株系进行病毒检测。病毒检测方法选用RT-PCR法，RT-PCR广泛应用于病毒检测和遗传病的诊断。(10)脱毒材料增殖分化:将经步骤(9)检测为脱毒苗的株系对应的愈伤组织进行增殖培养和诱导分化出苗；(11)脱毒苗壮苗生根:将步骤(10)脱毒愈伤组织上长出的组培苗转入壮苗生根培养基，待苗高3?4厘米时可出瓶种植，即为用于红掌生产的脱毒组培苗成品。所述的培养基，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与每升含量为:其中，所述诱导培养基为MS+6-BA 0.5?2.0mg/L+2.4-D0.3?m0.8g/L，所述的增殖培养基为MS+6-BA0.5?3.0mg/L,所述的分化培养基为MS+6-BA0.1?1.0mg/L,所述壮苗生根培养基为 1/2MS+NAA0 ?0.8mg/L+ 活性碳 0.5 ?lg/L。所述的MS为基本培养基中添加蔗糖或白糖为30g/L，琼脂为5?6g/L，pH调节为5.6?6.0 ;1/2MS基本培养基中添加蔗糖或白糖为20g/L，琼脂为5?6g/L，pH调节为5.6 ?6.0。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:(I)本专利技术以愈伤组织为脱毒处理材料，适用于红掌这类可通过愈伤增殖途径进行组培的植物，相比于通常采用的茎尖脱毒，具有体积大、操作容易、污染率低、变温热处理成活率闻的优点，因此，脱毒效率较莖尖脱毒闻。(2)以愈伤组织为脱毒处理材料，获得准脱毒母株数量较以茎尖为脱毒材料要多得多，即使整体脱毒率不高，也能在短期内获得较大数量的脱毒愈伤，缩短了生产周期。(3)采用组培苗作为病毒检测材料并分别标记，以对应脱毒愈伤为扩繁材料，保证了生产组培苗对所检测病毒的脱毒效果。(4)提出了对红掌愈伤组织热处理脱毒方法和适宜的温度、时间。【具体实施方式】以下通过实施例进一步说明本专利技术。实施例中MS培养基中添加蔗糖为30g/L，琼脂均为6g/L，pH为5.8 ；1/2MS培养基中添加鹿糖20g/L，琼脂为6g/L，pH为5.8。实施例1:取红掌阿拉巴马新展的嫩叶及叶柄为外植体，经灭菌处理:先用流水冲洗30分钟后用70%酒精浸泡1.0分钟,用无菌水冲洗后再用0.1 %的升汞溶液浸泡8分钟，再经无菌水冲洗5次。然后外植体切片、切段接种在诱导培养基MS+6-BA1.0mg/L+2.4_D 0.5mg/L上。60天后外植体上可见黄色颗粒状愈伤组织。将米粒大的愈伤组织连外植体一起接种到增殖培养基MS+6-BA 2.0mg/L上，增殖培养80天后，已有若干直径0.5?2厘米的愈伤团块，表面有分化的小芽。去除小芽，将愈伤组织置于38°C的人工气候箱8小时，再置于28°C的人工气候箱16小时，如此循环30天。经此变温热处理约有2/3的愈伤组织存活，将其接种到分化培养基MS+6-BA0.2mg/L上，40天肉眼可见表面小芽产生。将每个小芽单独接种到增殖培养基MS+6-BA 2.0mg/L上，已长根的切去根部。30?60天后芽基部膨大产生愈伤组织。将此愈伤组织一部分增殖继代，一部分接种到分化培养基上，每株的愈伤单独接种并标记。愈伤组织分化出的小植株按株系分别转接到壮苗生根培养基1/2MS+NAA 0.4mg/L+活性炭0.8g/L，待生长量足够时对株系进行RT-PCR法的病毒检测。RT-PCR法检测结果组培苗已脱去大棚取样植株所感染的芋花叶病毒，组培苗样品经检测80%脱毒。将检测为脱毒苗的株系对应的愈伤组织进行增殖培养和诱导分化出苗，再经壮苗生根培养，获得无芋花叶病毒的阿拉巴马脱毒组培苗。实施例2...

【技术保护点】
一种红掌脱毒培养的方法，其特征在于，所述脱毒培养的方法为以下步骤：(1)外植体准备：取红掌叶及叶柄，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(2)诱导培养：将步骤(1)的外植体切段或切片接种在诱导培养基上，经50～90天诱导出愈伤组织；(3)增殖培养：将步骤(2)愈伤组织接种在增殖培养基上，增殖继代数次；(4)变温热处理：将步骤(3)增殖培养后的愈伤组织先置于38～36℃环境中8～12小时，再置于32～26℃环境中16～12小时，再回到38～36℃环境，如此循环25～35天；(5)分化培养：将经步骤(4)处理后成活的愈伤组织接种到分化培养基上分化出苗；(6)准脱毒母株诱导培养：将步骤(5)分化出的苗作为准脱毒母株切去根部，每株单独接种到增殖培养基上；(7)准脱毒母株增殖和分化：将步骤(6)准脱毒母株基部产生的愈伤组织增殖继代，增殖后将愈伤组织任意分割成两部分，其中一部分增殖继代，另一部分接种到到分化培养基上，每株产生的愈伤单独接种并标记；(8)准脱毒株系生长：将步骤(7)愈伤组织在分化培养基上长出的小植株按株系分别转接到壮苗生根培养基培养；(9)病毒检测：对步骤(8)的组培苗按株系分别进行病毒检测；(10)脱毒材料增殖分化：将经步骤(9)检测为脱毒苗的株系对应的愈伤组织进行增殖培养和诱导分化出苗；(11)脱毒苗壮苗生根：将步骤(10)脱毒愈伤组织上长出的组培苗转入壮苗生根培养基，待苗高3～4厘米时出瓶种植于大棚，得到红掌脱毒组培苗。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓韵，田丹青，葛亚英，刘晓静，潘刚敏，
申请(专利权)人：浙江省萧山棉麻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33