一种单酶催化植物油制备天然香料的方法技术

一种单酶催化植物油制备天然香料的方法，其特征在于步骤：a、植物油水解，得到浓度为50～500mg/mL的植物油水解产物；b、取上述2.5～25uL植物油水解产物加入到0.25～2.5mL浓度为20～30mg/L的双功能酶蛋白溶液中，混匀后在18～22℃下震荡反应0.5～2.5h；c、在反应液中加入0.25～2.5mL乙醚，3～5℃避光震摇萃取50～70min，收集上层有机相；下层相中再加入乙醚重复抽提1～3次，后合并上层有机相，并加入1～5g无水硫酸镁充分干燥；d、将得到的有机溶剂相进行低温10～20℃旋转蒸发浓缩获得天然香料。采用植物油作为原料，来源丰富；采用酶法一步制备天然C5、C6、C7、C8、C9-烯醛类香料，制备工艺简单、易操作，同时反应条件温和、生产效率高，无有害物质产生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术生物香料制备
，具体是一种通过单酶一步催化植物油的水解物制 备短链烯醛类天然香料的方法。
技术介绍
天然植物油料在我国作为一种来源丰富的可再生的生物资源，有着重要的开发使 用前景，但目前仅经过简单处理就直接出口国外市场，进一步开发利用的力度远远不够，附 加值与利润率较低，深加工技术十分落后，环境污染和资源浪费十分严重，亟待进一步研究 与开发。对这部分油料进行加工，使之能够生产高附加值的产品，变废为宝。在现代生活 中，除了从天然物中提取香料外，还开发了其他途径进行香料的制成和提取，如有机合成的 方法、酶催化法等。由于人们对绿色化学品的要求日渐提高，使得化学合成法在食品风味料 生产中采用减少，而利用生物催化合成风味物质成为一条新兴路线。如Whitehead等人利 用大豆脂肪氧合酶结合植物氢过氧化物裂解酶形成了一条生产天然清香味化合物的工艺， 利用该法可得到卜己醇、顺-3-己烯-1-醇等。Noordermeer等以水解红花油、亚麻籽油为 原料，利用脂肪氧合酶和氢过氧化物裂解酶生产六碳和九碳醛类物质；Cass等人设计一种 中空纤维反应器进行番茄风味物质的生产。 由于酶法催化的环保性和安全性，现已越来越多被开发使用。但是，目前都是使用 双酶联用或者粗酶提取物方法进行，同时带来了酶反应体系不好控制、产物得率有所降低 等不良现象。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，具 有工艺简单易操作、成本低、生产高效快速的特点。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种单酶催化植物油制备天然香 料的方法，其特征在于包括以下步骤： a、先将植物油进行水解，得到浓度为50?500mg/mL的植物油水解产物； b、取上述2. 5?25uL植物油水解产物加入到0· 25?2. 5mL浓度为20?30mg/L 的双功能酶蛋白溶液中，混匀后在18?22°C下震荡反应0. 5?2. 5h ; c、在上述反应液中加入0. 25?2. 5mL乙醚，4?KTC避光震摇萃取50?70min， 收集上层有机相；并在下层相中再加入乙醚重复抽提1?3次，后合并上层有机相，并加入 1?5g无水硫酸镁充分干燥； d、将得到的有机溶剂相进行10?20°C低温下旋转蒸发浓缩获得天然香料。 作为改进，所述步骤a)的植物油水解的具体过程为：取100?500mg植物油，力口 2?5mL含5?7%(wt)K0H的甲醇水溶液，充氮气1?2min后55?65°C水浴1. 5?2. 5h ; 冷却，加1:0.9?1.1(>/￥)的]^1水溶液调节。!1至小于1;再加2?51]11^1:3?5(>八） 的氯仿/正己烧混合液抽提，3?5°C，9000?11000rpm/min离心4?6min，取上层有机相， 余下混合液再重复抽提1?3次，合并有机相，氮气吹干后用ImL色谱甲醇定容。 上述甲醇水溶液的体积比为3?5 :1。 作为优选，所述步骤b)中的双功能酶蛋白溶液为一种具有氢过氧化物裂解功能的 脂氧合酶PhLOX。脂氧合酶PhLOX的cDNA，它的核苷酸序列如SEQIDN0. 1所述。它的氨基 酸序列如SEQIDN0. 2所述。 作为改进，所述步骤c)的乙醚萃取的具体过程为：在的酶反应液中加1:0. 9?I. 1 (v/v)的乙醚震荡混勻，3?5°C，9000?11000rpm/min离心4?6min，取上层有机相，余下 混合液再重复萃取1?3次，合并有机相，加1?5g无水硫酸镁充分干燥。 再改进，所述步骤d)获得的天然香料为C5、C6、C7、C8、C9-烯醛类化合物。 最后，所述植物油为葵花籽、玉米油、芝麻油或者大豆油。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：采用植物油作为原料，原料来源丰富、成本 低；采用酶法一步制备天然C5、C6、C7、C8、C9-烯醛类香料，具有制备工艺简单、易操作，同 时反应条件温和、生产效率高且快速，无有害物质产生的特点，本专利技术为香料工业开辟一条 高效、快速生产烯醛类天然风味香料的新途径，并为食品添加剂工业和日化工业提供新的 物质基础。【具体实施方式】 以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。 实施例1 :双活性脂氧合酶蛋白PhLOX溶液的制备 采用TakaraRNAisoPluskit (Takara，日本)，以trizol法提取坛紫菜叶状体的总 RNA。采用 TakaraprimescriptRTreagentkit(Takara，日本)，对提取的坛紫菜叶状体总 RNA 进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。以此cDNA为模板，用一对带Nde I/Hind I I I酶 切位点的特异性引物扩增PhLOX基因的完整0RF，引物序列如下： 正向引物：5' GGAATTCCATATGATGGGGAATGCG3' 反向引物：5' CCCAAGCTTCTAGATGTCGATGGACAG3'。 克隆的目的片段首先连接到pMD-18T (Takara，日本）上形成L0X-18T的重组克 隆载体，通过转化E.c〇liDH5a进行测序，以检测目的片段的编码正确性。选择pET_28a (Takara，日本）为表达载体，在每40μL体系中，取L0X-18T和pET-28a空载体各lμg并 各自用2"勺恥6 1/把11(1111(8丨〇1^8，英国）进行双酶切，371：孵育211以上。取54 1^ 酶切产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，待质粒酶切完全后进行割胶回收和定量。在每 20 μ L体系中，将回收的目的片段和表达载体按135ng/50ng的比例进行连接，采用IU的T4 连接酶（Fermentas，美国）在4°C下连接过夜，以构建重组质粒L0X-28a。取所有连接液，与 100μ L感受态E. coliBL21(Takara，日本)快速混匀，冰中预冷30min，后42°C水浴热激90s， 热激后立即插在冰中，以构建重组体系L0X-28a-BL21。冰浴5min后加入800 μ L、4°C预冷 的LB液体培养基，37°C下200r/min摇菌2h。后取100 μ L菌液均匀涂布在含50 μ g/mL卡 那霉素（Kana+)的LB固体平板上。平板倒扣放置在37°C下避光培养12h?16h，用10 μ L 无菌移液枪头将肉眼可见的乳白色菌落挑取并溶解于20yL、含50μ g/mL卡那霉素的LB液 体培养基中。取1μ L该菌液作为模板，用上述带Nde I/Hindi I I酶切位点的特异性引 物进行PCR检测，检测程序同表1，PCR体系同表2。取5μ L该PCR产物通过1. 5%琼脂糖 凝胶电泳检测其对应菌液的真阳性，后将剩余19 μ L菌液转移至5mL的LB+Kana+ (50 μ g/ mL)液体培养基中扩大培养，37°C、200r/min、12h。取ImL菌液送测序以确定重组载体的编 码正确性，得到的真阳性克隆体LOX-28a-BL21。 表IPhLOX的PCR检测程序【主权项】1. ，其特征在于包括以下步骤： a、 先将植物油进行水解，得到浓度为50?500mg/mL的植物油水解产物； b、 取上述2. 5?25uL植物油水解产物加入到0. 25?2. 5mL浓度为20?30mg/L的双 功能酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单酶催化植物油制备天然香料的方法，其特征在于包括以下步骤：a、先将植物油进行水解，得到浓度为50～500mg/mL的植物油水解产物；b、取上述2.5～25uL植物油水解产物加入到0.25～2.5mL浓度为20～30mg/L的双功能酶蛋白溶液中，混匀后在18～22℃下震荡反应0.5～2.5h；c、在上述反应液中加入0.25～2.5mL乙醚，4～10℃避光震摇萃取50～70min，收集上层有机相；并在下层相中再加入乙醚重复抽提1～3次，后合并上层有机相，并加入1～5g无水硫酸镁充分干燥；d、将得到的有机溶剂相进行10～20℃低温下旋转蒸发浓缩获得天然香料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱竹君，陈海敏，严小军，骆其君，杨锐，陈娟娟，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33