石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用制造技术

本发明专利技术公开石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用。本发明专利技术利用病毒滴度和实时定量PCR检测了石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP对NNV病毒复制的抑制作用。本发明专利技术的石斑鱼Ec-TCTP是一种具有抗病毒功能的翻译控制肿瘤蛋白基因，用该基因构建真核表达载体，并将表达载体通过转染方法导入石斑鱼脑细胞中，得到能过量表达Ec-TCTP的稳定细胞，具有提高细胞对病毒感染的耐受能力；经实验证明了石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白确实具有抑制RNA病毒复制的特点，石斑鱼Ec-TCTP基因克隆和功能分析的研究将对进一步研究和开发抗病功能蛋白具有重要的科学价值和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用。本专利技术利用病毒滴度和实时定量PCR检测了石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP对NNV病毒复制的抑制作用。本专利技术的石斑鱼Ec-TCTP是一种具有抗病毒功能的翻译控制肿瘤蛋白基因，用该基因构建真核表达载体，并将表达载体通过转染方法导入石斑鱼脑细胞中，得到能过量表达Ec-TCTP的稳定细胞，具有提高细胞对病毒感染的耐受能力；经实验证明了石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白确实具有抑制RNA病毒复制的特点，石斑鱼Ec-TCTP基因克隆和功能分析的研究将对进一步研究和开发抗病功能蛋白具有重要的科学价值和应用价值。【专利说明】石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因在抗鱼类神 经坏死病毒方面的应用
： 本专利技术属于基因工程领域，具体涉及石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基 因在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用。
技术介绍
： 翻译控制肿瘤蛋白（Tranlationally Controlled Tumor Protein, TCTP)，又称 P21、P23以及fortilin。对TCTP蛋白序列研宄分析发现，TCTP蛋白亚基具有2个典型的 特征序列，TCTPl和TCTP2,并且带有一个微管结合区（Gachet et al.，1999)和Ca2+结合区 域（Kim et al.，2000)。 石斑鱼，隶属于自卢形目（Perciformes)、齠科（Settauida)、石斑鱼亚科 (Epinephelina)。广泛分布于印度洋和太平洋的热带海域，我国南海及东海南部均有分布， 其中南海较多，常年均可捕获，以春、夏季为渔获旺季。据鱼类学家研宄记载，石斑鱼属种类 较多，全世界有400种以上，我国产的石斑鱼亚科有13属，79种，但目前仅有约6种石斑鱼 可人工饲养，石斑鱼肉质鲜美蛋白含量高，是一种经济价值很高的食用鱼类，也是我国创汇 的优良鱼类品种（陆忠康，1996)。从20世纪90年代开始，石斑鱼养殖进入了产业化养殖 阶段。随着石斑鱼饲养密度的增加，鱼体抵抗病原的侵袭和感染的能力有所降低，从而使一 些鱼类疾病频繁爆发，造成了重大的经济损失。由于病毒具有的独特生物学特性和鱼类特 有的水生环境特点，使得鱼类病毒性疾病具有很强的传染性、致病性和严重的破坏力，已经 成为鱼类重要的致病病源之一。鱼类神经坏死病毒（nervous necrosis virus，NNV)，是一 种世界范围内流行的海水鱼类病毒病，主要发生在海水鱼类种苗生产阶段，是近几年来石 斑鱼苗种培育中危害最大的病原，鱼苗死亡率高达90%以上，给石斑鱼养殖业的发展带来 严重的危害。目前对鱼类病害的防治，主要是采用抗生素和化学药物，造成了药物残留、耐 药性及环境污染等严重问题。为此，开展鱼类免疫抗病的基础研宄及研制新型抗病基因工 程制品已经成为当务之急。翻译控制肿瘤蛋白TCTP广泛存在于动物、植物和真菌中，参与 多种生物学过程，具有多种生物学功能，如抗凋亡、抗病毒等（Th aw et al.，2001)，应用潜 力很大。目前，石斑鱼TCTP对神经坏死病毒的抗病毒作用还未见报道。
技术实现思路
： 本专利技术的第一个目的是提供石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP在抗鱼类神经坏死病 毒方面的应用。本专利技术利用病毒滴度和实时定量PCR检测了石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP 对NNV病毒复制的抑制作用。 所述的石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。 本专利技术的第二个目的是提供石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP的编码基因 Ec-TCTP 在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用。 所述的石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP的编码基因 Ec-TCTP，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。 本专利技术是通过以下步骤来检测石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP及其编码基因对鱼 类神经坏死病毒复制的抑制作用的： (1)、根据已知的石斑鱼Ec-TCTP基因 CDNA全长序列，设计如下构建真核表达载体 的特异性引物： pcDNA-TCTP-S ：CCCAAGCTTATGATCATCTACAGGTGCA pcDNA-TCTP-R ：CGGGATCCTTAGCATTTCTCTTCCACCAG 引物pcDNA-TCTP-S含有限制性内切酶Hind III识别位点，pcDNA-TCTP-R含有限制 性内切酶BamHI识别位点； (2)、提取石斑鱼肝脏组织RNA，并以RNA为模板用反转录酶合成cDNA，再以石斑鱼 cDNA为模板，采用步骤（1)中设计的特异性引物，在PCR扩增体系中对Ec-TCTP基因的cDNA 进行扩增，同时回收纯化Ec-TCTP基因片段； (3)、使用Hind III和BamHI对步骤⑵纯化得到的Ec-TCTP基因片段进行双酶切 获得带有两个酶切位点的Ec-TCTP基因，同时用HindIII和BamHI对真核表达载体pcDNA3. 1 进行双酶切，连接转化大肠杆菌，抽质粒进行PCR和双酶切检测，确定真核重组表达载体构 建成功； (4)、培养石斑鱼脑细胞（GB)，转染去内毒素质粒pcDNA3. 1和pcDNA3. 1-Ec-TCTP， 用G418筛选过表达细胞系； (5)、NNV感染稳定筛选的细胞系，于12和24小时收集样品，提取RNA，反转录成 cDNA，利用实时定量PCR检测Ec-TCTP对NNV病毒复制的作用，同时检测病毒滴度变化。 所述的真核表达载体为pcDNA3. 1。 本专利技术的石斑鱼Ec-TCTP是一种具有抗病毒功能的翻译控制肿瘤蛋白基因，用该 基因构建真核表达载体，并将表达载体通过转染方法导入石斑鱼脑细胞中，得到能过量表 达Ec-TCTP的稳定细胞，具有提高细胞对病毒感染的耐受能力；经实验证明了石斑鱼翻译 控制肿瘤蛋白确实具有抑制RNA病毒复制的特点，石斑鱼Ec-TCTP基因克隆和功能分析的 研宄将对进一步研宄和开发抗病功能蛋白具有重要的科学价值和应用价值。 【专利附图】【附图说明】： 图1为石斑鱼肝组织RNA电泳检测图，1和2泳道为RAN ; 图2为Ec-TCTP基因扩增电泳图，M为DL2000,1-7泳道为PCR产物； 图3为真核重组表达载体pcDNA3. I-Ec-TCTP PCR检测电泳图，M为DL2000,1-3泳 道为菌落PCR产物，4泳道为对照； 图4为稳定筛选GB细胞系，1为GB细胞，2为稳定筛选pcDNA3. 1细胞系，3为稳定 筛选 pcDNA3. I-Ec-TCTP 细胞系； 图5为PCR检测稳定筛选细胞系，1为对照，2为pcDNA3. 1，3为 pcDNA3. I-Ec-TCTP ； 图6为病毒滴度检测Ec-TCTP基因对病毒复制的影响，其中，pcDNA3. 1和 pcDNA3. I-Ec-TCTP 的显著性差异用 one-way ANOVA 分析，分别用# 表示（ρ〈0· 01) (N= 3); 图7为NNV感染稳定筛选细胞系后的RNA检测图，1-2为pcDNA3. 1细胞系12和 24小时样品，3-4为pcDNA3. I-Ec-TCTP细本文档来自技高网...

【技术保护点】
石斑鱼翻译控制肿瘤蛋白TCTP在抗鱼类神经坏死病毒方面的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏京广，秦启伟，周胜，许濛，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44