本发明专利技术公开了一种爬行动物来源的抗菌肽Alligatorin5及其氨基酸序列和在抗菌方面的应用。本发明专利技术的抗菌肽Alligatorin5来源于扬子鳄，通过检索扬子鳄基因数据库，筛选分析获得抗菌肽成熟肽序列，抗菌肽Alligatorin5氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。通过对比分析，爬行动物抗菌肽Alligatorin5与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异，属于一种新型抗菌肽。通过抗菌实验表明，本发明专利技术的扬子鳄抗菌肽Alligatorin5对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌具有极强的抗菌活性，抗菌作用广谱高效，此外具有溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的等特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。
【技术实现步骤摘要】
一种爬行动物抗菌肽Alligatorin5及其应用
本专利技术涉及一种爬行动物来源的抗菌肽及其应用，更具体的说，涉及一种来源于爬行动物扬子鳄的抗菌肽及其应用，属于生物医学
技术介绍
传统抗生素在治疗细菌性感染疾病方面取得了显著效果，但是近年来，随着传统抗生素在医学和养殖业等领域的滥用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，微生物耐药问题已成为严重威胁人类健康的难题。一直以来微生物耐药性的应对手段是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗微生物制剂，而这种新的抗生素使用一段时间后，微生物会进一步对这种新的抗生素产生耐药性，因此这就需要持续开发新的抗微生物制剂。开发出一种新型抗菌机制药物是解决微生物耐受性问题的一个新方向。抗菌肽是一种小分子多肽，对细菌、真菌、病毒和原虫等均具有杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、杀菌活性强等特点。大多数抗菌肽的杀菌机制是通过作用于细菌细胞膜上的磷脂双分子层，破坏细胞膜完整性并在细胞膜上形成跨膜通道，造成细胞内容物溶出而导致细胞死亡。这种独特的杀菌机制一般不易引起微生物耐药性。而且抗菌肽对哺乳动物正常细胞和组织一般没有毒害性，不存在残留问题，因此抗菌肽有望成为一种新型的高效的抗菌药物，具有广阔的开发应用前景。
技术实现思路
本专利技术目的是为解决传统抗生素的不足之处，提供了一种来源于爬行动物扬子鳄的抗菌肽Alligatorin5，另外提供了该抗菌肽的氨基酸序列以及其在抗菌方面的应用。爬行动物抗菌肽Alligatorin5具有广谱高效的抗菌作用，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌具有极强的抗菌活性，且具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术中抗菌肽Alligatorin5是源自于爬行动物扬子鳄体内的一种抗菌肽，爬行动物抗菌肽Alligatorin5由22个氨基酸组成，分子量为2557.1Da，等电点为12.03，氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示：ThrArgArgLysPheTrpLysLysValLeuAsnGlyAlaLeuLysIleAlaProPheLeuLeuGly，所有氨基酸均为L-型；本专利技术也提供了抗菌肽Alligatorin5的化学制备方法：根据获得的爬行动物抗菌肽Alligatorin5成熟肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化；用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构；另外，本专利技术提供了抗菌肽Alligatorin5的应用，在制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。本专利技术的优点是提供了一种来源于扬子鳄的爬行动物抗菌肽Alligatorin5以及其在抗菌方面的应用。抗菌肽Alligatorin5具有广谱高效的抗菌作用，且具有分子量小、合成简单、溶血活性低、盐耐受性、热耐受性和热稳定性好的特点，可应用于医药、化妆品、食品保鲜和养殖业领域。具体实施方式实施例1：爬行动物抗菌肽Alligatorin5的发现通过检索，从美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的扬子鳄基因组数据中发现一条基因序列(XP_006026473.1)，长度为477bp，编码的多肽前体由158个氨基酸残基组成。该基因及其编码的多肽前体分别如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示：将该基因序列用NCBI网站的blastX软件(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastx&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)进行序列比对分析结果表明，该基因的编码产物可能为扬子鳄cathelicidins家族抗菌肽前体。进一步将该基因编码的多肽前体序列用NCBI网站的proteinblast软件(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)进行序列比对，并与之前发现的其它动物来源cathelicidins家族抗菌肽序列进行比较分析，确定该抗菌肽成熟过程中的酶切位点为-L135-V136-，从而获得该抗菌肽成熟肽序列为TRRKFWKKVLNGALKIAPFLLG(氨基酸单字母简写序列)，命名为Alligatorin5。Alligatorin5与目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明显差异。实施例2抗菌肽Alligatorin5的化学合成方法(1)用自动多肽合成仪(433A,AppliedBiosystems)合成Alligatorin5的全序列，通过HPLCC18反相柱层析脱盐纯化。(2)分子量测定采用常规基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)法。(3)纯化的Alligatorin5用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度>95％，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF，2557.1Da)，等电聚焦电泳测定等电点为12.03，用自动氨基酸测序仪确定其氨基酸序列结构与天然Alligatorin5一致。实施例3：抗菌肽Alligatorin5抗菌活性检测(1)分别挑取保存于斜面上的试验菌株(大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC27853购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其它菌株从当地医院收集)均匀涂布于MH固体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的Alligatorin5样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。结果表明，抗菌肽Alligatorin5对表2中列出的菌株种类均具有抗菌活性。(2)采用2倍稀释法测定最小抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration)：选择上述实验步骤(1)中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。将试验菌株接种到MH液体培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)中，然后在培养箱中37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的菌株培养液稀释到2×105cfu/ml待用。在无菌96孔板各孔中预先加入100μlMH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的Alligatorin5样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种爬行动物抗菌肽Alligatorin5，其特征在于，所述抗菌肽来源于扬子鳄，由22个氨基酸组成，分子量为2557.1Da，等电点为12.03，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示Thr Arg Arg Lys Phe Trp Lys Lys Val Leu Asn Gly Ala Leu Lys Ile Ala Pro Phe Leu Leu Gly，所有氨基酸均为L‑型。
【技术特征摘要】
1.一种爬行动物抗菌肽Alligatorin5，其特征在于，所述抗菌肽来源于扬子鳄，由22个氨基酸组成，分子量为2557.1Da，等电点为12.03，氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示ThrArgArgLysPheTrpLysLysValLeuA...
【专利技术属性】
技术研发人员：王义鹏，于海宁，陈燕，卫林，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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