一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法，在确定产琥珀酸放线杆菌ATCC55618菌株生长的临界pH为4.5之后，对其进行紫外诱变，筛选出能够在pH4.3的固体平板上生长的菌株M1，对M1进行两轮紫外-亚硝基胍复合诱变，筛选出琥珀酸高产菌株AS-R2，该菌株在pH4.1条件下可以生长繁殖，但是在pH5.0条件下，产酸量仅为16.54g/L。本发明专利技术采用基因组改组技术对AS-R2进行3轮基因改组，获得了耐酸性高产菌株AS-F3-2，能够在pH3.2的从条件下生长繁殖，在pH5.0条件下，发酵36h，产琥珀酸产量达25.2g/L。

【技术实现步骤摘要】
一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法。
技术介绍
琥珀酸(SuccinicAcid)是一种二羧酸，是常见的天然有机酸，又名丁二酸，是三羧酸循环的产物之一，其在人体、动物、植物和微生物中广泛存在。琥珀酸作为一种C4平台化合物，用途极为广泛，目前在食品、农业、医药、化学等领域都有广泛应用。现有琥珀酸的生产方法主要有化学合成法，但是化学合成法对石化材料和电耗需求大，石化材料不可再生，资源有限且会造成严重的环境污染；近年来，微生物发酵法成为关注的热点，但是目前琥珀酸生产菌株的产量仍是工业化生产的瓶颈问题。发酵生产琥珀酸的微生物种类很多，目前主要报道的有大肠杆菌(Escherichiacoli)、产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniproducens)、产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)、曼氏琥珀酸产生菌(Mannheimiasucciniciproducen)和酵母等。其中，产琥珀酸放线杆菌被认为是目前最有潜力用于工业化发酵生产琥珀酸的菌种。密歇根大学和密歇根生物技术研究所筛选的兼性厌氧菌A.succiniproducens130Z(A.succiniproducensATCC55618)，产琥珀酸产量可达70g/L；Guettler等人以A.succiniproducens130Z作为出发菌株，采用诱变选育的技术筛选得到突变株，所得突变菌株的产琥珀酸量在最高时可以达到80g/L，该菌株生长和产酸的最佳pH均为6.8。韩国科学技术研究院研究组筛选曼氏琥拍酸杆菌报道的最高产琥拍酸水平为52.4g/L。我国合肥工业大学的李兴江等人对A.succinogene(实验室筛得)采用60Co-γ辐照进行诱变，筛选得到了突变株HF417，其产乙酸的浓度由25.7g/L降低到了4.5g/L，而且产得的琥珀酸量由45g/L增加到了67g/L。南京工业大学姜岷等筛选了一株产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)NJ113(保藏编号为CGMCCNo.1716)，其发酵液最高产琥珀酸37℃发酵45小时后丁二酸产量可以达到45g/L，生长pH范围为5.0～8.0，最适产酸pH7.0。郑璞等从牛的瘤胃中筛选到一株产琥珀酸的野生菌株，通过菌种鉴定确认为产琥珀酸放线杆菌CGMCC1593，通过NTG诱变选育氟乙酸钠抗性突变株，得到产量提高的诱变菌株SF-9，发酵36h可积累琥珀酸40.5g/L，应用基因组改组技术选育到耐钠、氟乙酸钠抗性改组菌CGMCC2653，5L发酵罐中补料分批发酵48h产琥珀酸53.96g/L，后来选育的CGMCC1593，采用补料分批发酵，48h产琥珀酸95.6g/L。但是这些菌株的耐酸性差，最适产酸pH均为中性左右，这就使发酵过程中必须采用碱中和维持菌株产酸的最适pH条件，导致产品分离提取过程中产生大量的盐，给环境带了一定的污染。耐酸性菌株在发酵产酸过程中需要中和碱的量少，分离提取产生的盐少，为此筛选耐酸性菌株成为目前人们研究的重点。刘璇等采用基因组改组技术选育耐酸性琥珀酸放线杆菌F3-21，其在5L发酵罐中补料分批发酵，控制pH在5.6～6.0时，48h积累琥珀酸38.1g/L。现有琥珀酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法对石化材料和电耗需求大，且会造成环境污染；微生物发酵又被菌株培养条件及产量所限制。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种耐酸性高产琥珀酸的菌株及其制备方法，旨在解决现有琥珀酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学合成法对石化材料和电耗需求大，且会造成环境污染；微生物发酵又被菌株培养条件及产量所限制的问题。本专利技术实施例是这样实现的，一种耐酸性高产琥珀酸的菌株，该耐酸性高产琥珀酸的菌株以一株产琥珀酸放线杆菌为原始菌株，通过紫外线和亚硝基胍诱变，再经基因组改组筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2；产琥珀酸放线杆菌AS-F3-2，由原始菌株产琥珀酸放线杆菌ATCC55618经复合诱变和基因组改组后筛选获得，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.9099。所述菌株是以一株产琥珀酸放线杆菌(A.succiniproducens)为原始菌株，通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变，分别通过pH4.1和溴甲酚绿平板筛选获得耐酸和产量提高菌株AS-UV1，AS-UV2，AS-NTG1和AS-NTG2；分别将上述4株突变菌株进行原生质体制备，并等量混匀后均分为2份，一份采用加热灭活，另一份采用紫外灭活，然后混合进行原生质体融合、再生，并在pH3.8和溴甲酚绿平板筛选获得耐酸和产量提高F1代突变菌株AS-F1-8；然后将F1代菌株制备原生质体，进行第二轮基因组改组，连续经3轮基因组改组后筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2(CGMCC9099)，该菌株在pH3.2条件下可以生长繁殖，在pH5.0条件下，产酸量25.2g/L。本专利技术实施例的另一目的在于提供一种耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法，该耐酸性高产琥珀酸的菌株制备方法包括以下步骤：步骤一，菌株诱变，对产琥珀酸放线杆菌菌株AS-R2分别进行紫外线诱变和亚硝基胍诱变；步骤二，诱变菌株的筛选，在耐酸平板上筛选出经紫外线诱变和亚硝基胍诱变后耐酸性最强的菌落，刮到生理盐水中，梯度稀释，涂布于溴甲酚绿平板，厌氧培养箱内37℃下培养3～5d；挑选变色圈较大的菌落，记号笔做标记，分别挑取一环变色圈较大的菌落于发酵培养基中培养，并测琥珀酸产量；产量高的菌株继续用于基因组改组；步骤三，第一轮基因组改组，以诱变筛选得到的多株突变株为出发菌株，制备原生质体，并对所制备的原生质体灭活，再融合，最后筛选F1代突变株；步骤四，第二轮基因组改组，以第一轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F2代突变株；步骤五，第三轮基因组改组，以第二轮基因组改组得到的融合子为出发菌株，继续原生质体制备、灭活与融合，并筛选F3代突变株；步骤六，对获得的F3代突变株传代10次，验证遗传稳定性，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS-F3-2。进一步，在步骤一中，菌株诱变的方法包括：第一步，紫外线诱变：挑取原始菌株－－产琥珀酸放线杆菌于装有活化培养基的试管中，活化24h，以3％接种量接种于装有活化培养基的试管中进行二次活化，活化24h，再以3％接种量接种于装有发酵培养基的三角瓶中，培养至对数期，取5ml于已灭菌的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌棒，紫外灯下30cm处于磁力搅拌器上紫外照射50s，时间到，关闭磁力搅拌器，取1ml诱变菌液于9ml生理盐水，梯度稀释至10-7，取梯度为10-5、10-6及10-7的菌液涂布于pH4.1平板上，每个梯度涂10个平板，于厌氧培养箱内37℃下避光培养3～5d；第二步，亚硝基胍诱变：出发菌株培养至对数期，取4.75ml菌液，加入0.25ml亚硝基胍母液，终浓度为500μg/mL，于37℃保温90min，以冷的生理盐水稀释100倍，终止反应，生理盐水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐酸性高产琥珀酸的菌株，其特征在于，该耐酸性高产琥珀酸的菌株以一株产琥珀酸放线杆菌为原始菌株，通过紫外线和亚硝基胍诱变，再经基因组改组筛选，获得耐酸性强且琥珀酸产量高的突变株AS‑F3‑2；产琥珀酸放线杆菌AS‑F3‑2，由原始菌株产琥珀酸放线杆菌ATCC 55618经复合诱变和基因组改组后筛选获得，已经保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CGMCC9099。

【技术特征摘要】
1.一种产琥珀酸的菌株，其特征在于，该产琥珀酸的菌株保藏于中国微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉华，夏飞飞，姚曼，于寒松，刘俊梅，朴春红，代伟长，刘彦隆，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22