一种4-羟基依卡精的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种4-羟基依卡精的制备方法，运用二维液相色谱技术，从天然产物马钱子子实体中提取4-羟基依卡精，通过色谱柱、溶解液、流动相等的合理选择，流速、洗脱方式、收集区段等工艺条件的优化，使得整个分离纯化方法切实可行，操作简便，仪器自动化程度高，常温常压下就可进行，重复性高，得到的物质组分批次之间一致性高，可操作性好，且得到的4-羟基依卡精纯度高，可以达到99％以上，可以直接运用于工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化合物生产领域，尤其是一种4-羟基依卡精的制备方法。
技术介绍
生物碱类化合物在中药动物药中分布广泛，其化学结构复杂多样，生物活性显著。一些结构新颖的生物碱具有引人注目的生理和药理活性，有可能是治疗一系列人类重大疾病药物的重要来源。4-羟基依卡精就是这样的一种生物碱类化合物，是广泛存在于植物体内的一种重要的天然活性成分，其结构如下：目前发现4-羟基依卡精有如下作用：第一，其对增殖分化的细胞以及肿瘤细胞具有抑制其增殖分化和细胞毒性的作用，诱导细胞凋亡，因此，4-羟基依卡精抑制肿瘤的活性。第二，整个中枢神经系统都有兴奋作用，并提高大脑皮质的感觉中枢机能。第三，镇痛作用：实验表明用小鼠腹腔注射乙酸的扭体法，小鼠肌肉注射，镇痛作用的ED50为12.68mg/Kg.小鼠热板法证明有镇痛作用。其镇痛作用与M胆碱受体有一定的联系。到目前为止，在天然产物提取物中提取4-羟基依卡精的方法还少有见报道，而且比较繁琐，更不用说提取到高纯度或者单体4-羟基依卡精了，这在一定程度上也阻碍了4-羟基依卡精在作为中药开发方面的进展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种4-羟基依卡精的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种4-羟基依卡精的制备方法，具体步骤如下：(1)以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后，用乙酸乙酯浸泡或者回流提取1-2h，提取1-3次，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，用乙醇体积分数为20-50％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解，得到马钱子浓度为50-200mg/mL的提取液；(2)对得到的提取液进行液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为1000-5000μL mL/针；流动相流速为50-200mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；洗脱方式：B相浓度0％等度5min、B相浓度0％-64％梯度5-35min、B相浓度64％-100％梯度35-45min；根据紫外吸收光谱收集其中的峰7(保留时间28-33min)作为目的组分，旋转蒸发至干，得到一维液相组分；(3)用乙醇体积分数为25-50％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为500-2000μL/针；流动相流速为10-30mL/min；；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；等度洗脱方式：40％B相等度45min洗脱；根据紫外吸收光谱收集其中的5峰(保留时间31-32min)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目标产物4-羟基依卡精。优选的，上述4-羟基依卡精的制备方法，所述步骤(2)中液相色谱采用的色谱柱为正相硅胶轴向加压色谱柱(Innovel silica 150×250mm，10μm，)，使用时柱温为室温或25-40℃。优选的，上述4-羟基依卡精的制备方法，所述步骤(4)中二维液相色谱采用的色谱柱为DAISO硅胶色谱柱(DAISO Silica 20×250mm，5μm，)，使用时柱温为室温或25-40℃。本专利技术的有益效果是：上述4-羟基依卡精的制备方法，运用二维液相色谱技术，从天然产物马钱子子实体中提取4-羟基依卡精，通过色谱柱、溶解液、流动相等的合理选择，流速、洗脱方式、收集区段等工艺条件的优化，使得整个分离纯化方法切实可行，操作简便，仪器自动化程度高，常温常压下就可进行，重复性高，得到的物质组分批次之间一致性高，可操作性好，且得到的4-羟基依卡精纯度高，可以达到99％以上，可以直接运用于工业生产。附图说明图1为实施例2中从马钱子子实体中提取4-羟基依卡精的一维高效制备液相色谱图；图2为实施例2中从马钱子子实体中提取4-羟基依卡精的一维高效制备液相色谱分离所得馏分7号的二维高效制备液相色谱图；图3为实施例2中得到的目的组分的分析型高效液相色谱图；图4为4-羟基依卡精的1HNMR谱图；图5为4-羟基依卡精的13CNMR谱图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本专利技术所述技术方案作进一步的详细说明。除非另有说明，本专利技术使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的相同含义。实施例1：以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯提取旋蒸得到干燥的马钱子粗粉后称取5g，溶于100mL 20％的乙醇-正己烷溶液，制得马钱子提取物溶液，浓度为50mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用Innovel silica 150×250m，10μm，流动相采用的为有机相的混合，其中有机相A相是正己烷，B相是乙醇，洗脱方式：B相浓度0％等度5min、B相浓度0％-64％梯度5-35min、B相浓度64％-100％梯度35-45min。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为5000μL/针，流动相流速为80mL/min，收集28-33分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备4-羟基依卡精粗品。用40％的乙醇-正己烷溶液溶解4-羟基依卡精粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为DAISO Silica 20×250mm，5μm，流动相采用的为有机相的混合，其中有机相A相是正己烷，B相是乙醇，采用40％B相等度45分钟洗脱。采用紫外检测器210nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为1000μL/针，流动相流速为16mL/min，收集31-32分钟的馏分，旋转蒸发至干，得到4-羟基依卡精化合物，经液相色谱分析，纯度为98.9％，一维制备4-羟基依卡精粗品中4-羟基依卡精的含量为23％。实施例2：以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后用乙酸乙酯提取旋蒸得到干燥的马钱子粗粉后称取10g，溶于100mL 30％的乙醇-正己烷溶液，制得马钱子提取物溶液，浓度为100mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用Innovel silica 150×250mm，10μm，流动相采用的为有机相的混合，其中有机相A相是正己烷，B相是乙醇,洗脱方式：B相浓度0％等度5min、B相浓度0％-64％梯度5-35min、B相浓度64％-100％梯度35-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种4‑羟基依卡精的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后，用乙酸乙酯浸泡或者回流提取1‑2h，提取1‑3次，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，用乙醇体积分数为20‑50％的乙醇‑正己烷二元混合溶剂溶解，得到马钱子浓度为50‑200mg/mL的提取液；(2)对得到的提取液进行液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为1000‑5000μL mL/针；流动相流速为50‑200mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200‑260nm；洗脱方式：B相浓度0％等度5min、B相浓度0％‑64％梯度5‑35min、B相浓度64％‑100％梯度35‑45min；根据紫外吸收光谱收集其中的峰7保留时间28‑33min作为目的组分，旋转蒸发至干，得到一维液相组分；(3)用乙醇体积分数为25‑50％的乙醇‑正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50‑100mg/mL；(4)进行二维液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为500‑2000μL/针；流动相流速为10‑30mL/min；；检测器为紫外检测器，检测波长200‑260nm；等度洗脱方式：40％B相等度45min洗脱；根据紫外吸收光谱收集其中的5峰保留时间31‑32min作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目标产物4‑羟基依卡精。...

【技术特征摘要】
1.一种4-羟基依卡精的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)以马钱子子实体为原料，磨成粉末状后，用乙酸乙酯浸泡或者回流提
取1-2h，提取1-3次，过滤，所得滤液进行旋转蒸发至干，用乙醇体积分数为
20-50％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解，得到马钱子浓度为50-200mg/mL的
提取液；
(2)对得到的提取液进行液相色谱分离：采用的流动相为二元混合有机相，
其中A相是正己烷，B相是乙醇；进样量为1000-5000μL mL/针；流动相流速为
50-200mL/min；检测器为紫外检测器，检测波长200-260nm；洗脱方式：B相浓
度0％等度5min、B相浓度0％-64％梯度5-35min、B相浓度64％-100％梯度35-45min；
根据紫外吸收光谱收集其中的峰7保留时间28-33min作为目的组分，旋转蒸发至
干，得到一维液相组分；
(3)用乙醇体积分数为25-50％...

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，李上文，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12