核酸复合物及核酸多糖复合物制造技术

本发明专利技术的课题在于提供一种即使在生物体内也不会在DNA与RNA的连结部被分解的核酸复合物，作为该课题的解决手段，提供一种核酸复合物，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的核酸复合物，其中，与单链DNA结合的核糖核苷酸链的5'侧末端核苷酸的2'位的羟基被烷氧基或卤素基团置换，和/或与单链DNA结合的最初的核糖核苷酸的3'位与和其相邻的核糖核苷酸的5'位之间的磷酸二酯基被硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基中的任一个置换。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸复合物及核酸多糖复合物
本专利技术涉及一种提高包含DNA与RNA的核酸复合物的血清中稳定性的技术。
技术介绍
人类基因组的解读，已经在距离发现DNA双螺旋结构的1953年之后的第50年、即 2003年完成。目前，正在进行阐明各种蛋白质的活性机理以及蛋白质间的相互作用。并且 最近逐渐了解到，不编码蛋白质的RNA控制着基因的转录、翻译。作为应用这样的成果的方 法之一，提出了使用具有生理活性的短人工核酸（核酸药物）操控生物体功能的技术。 小干扰RNA(small interfering RNA，即siRNA)是由21?23个喊基对构成的低 分子双链RNA。siRNA参与被称为RNA干扰（RNAi)的现象（参照非专利文献1)、序列特异 性地阻遏信使RNA (mRNA)，抑制蛋白质表达。通常认为，该现象是生物体作为应对病毒感染 等的防御机制的一环节而逐渐进化形成的。由于仅基于基因序列信息就能够设计出，因此 不需要如此前的低分子药物那样的大规模筛选，此外，由于能够特异性地阻遏特定基因，因 此认为副作用小，预期将成为新一代治疗药。 但是，作为天然型核酸的磷酸酯型RNA，在生物体内由于核酸酶、与蛋白质的非特 异性吸附会在极短时间内失活。因此，天然型核酸药品在人类临床研宄中并未带来有意义 的效果。为了解决天然型核酸这样的在生物体环境内和培养液中短时间内失活的问题，提 出了多种对天然型核酸进行化学修饰而成的化学修饰核酸。尤其已知的是：例如将核糖的 2'-位的羟基用甲氧基（2'-0_甲基）（参照非专利文献2)、氟（F)(参照非专利文献3)、锁 式核酸（locked nucleic acid) (LNA)(参照非专利文献4)进行化学修饰而得到的化学修 饰核酸。此外，还报道了这样的化学修饰使得siRNA与靶mRNA的结合亲和性提高。 将这样的化学修饰核酸称为核酸类似物。核酸类似物与天然型核酸相比成功地大 幅度延长了失活时间。这是由于核酸酶无法识别核酸类似物。但是，产生了在生物体内与 蛋白质发生非特异性吸附、无法预期的生理活性、引起重度肝损伤等由非天然所带来的毒 性问题。 还提出了如下技术：将天然型核酸包封至具有生物体适合性的化合物中，保护核 酸不被分解，并且改善膜透过性从而将核酸导入细胞内。逆转录病毒（参照非专利文献5) 或腺病毒（参照非专利文献6)等虽然已经获知作为基因载体在体外是极有前途的，但是这 些天然来源的病毒的炎症性、免疫原性、以及诱导突变及重组到细胞基因组中风险性也备 受指摘，这些使其在体内的使用受到限制。 因此，提出了一种作为天然来源的基因载体的代替物的、不仅操作比病毒系统简 单而且能够使DNA切实向细胞高效率集中的、人工材料作为非病毒载体的用途（参照非专 利文献7)。迄今为止，作为非病毒性的人工核酸载体，已经开发出聚乙二醇修饰的多聚阳离 子（参照非专利文献8)、聚乙烯亚胺（参照非专利文献9)、阳离子性聚合物的嵌段共聚物 (参照非专利文献10)、树枝状高分子（参照非专利文献11)等。但是，这样的阳离子性高 分子的安全性尚未确认。为了具有阳离子性，氨基的存在是必不可少的，但是氨基的生理活 性高，存在体内毒性等风险。 本专利技术人着眼于此前作为基因载体的β -1，3-葡聚糖，已经发现了 β -1，3-葡聚 糖与核酸药物（反义DNA、CpG DNA)形成新型的复合物的现象（参照专利文献1、2,非专利 文献 12、13、14)。 我们发现，将天然以3螺旋存在的β -1，3-葡聚糖溶解于二甲基亚砜（DMSO)等非 质子性极性有机溶剂、或0. IN以上的碱溶液使其解离为单链后，加入单链的核酸，使溶剂 变为水或恢复至中性，由此形成了由1分子核酸与2分子多糖构成的3螺旋复合物。我们 认为，此时，3螺旋复合物中的多糖分子与核酸分子主要是通过氢键与疏水性相互作用而形 成分子间结合的（参照非专利文献15)。 如上所述，已经报道了与β -1，3-葡聚糖复合化的核酸为单链核酸，尤其聚脱氧 腺嗓呤（poly dA)、聚胞喃啶（poly C)与以西佐喃（sizofiran，SPG)为首的β-1，3-葡聚 糖显示出强亲和性。 对于以β-1，3-葡聚糖作为SiRNA的载体应用于RNAi也进行了研宄。但是，SiRNA 为双链核酸，因此不能直接与β-1，3-葡聚糖形成复合物。因此，为了与SPG等β-1，3-葡 聚糖复合化，准备了对siRNA的正义链附加 poly (dA)而成的DNA-RNA杂化核酸，使其与 siRNA的反义链退火，从而制作了 poly (dA)-siRNA。然后，利用poly (dA)部分与SPG进行 复合化。 现有技术文献 专利文献 专利文献1:国际公开第01/34207号小册子 专利文献2:国际公开第02/072152号小册子 非专利文献 非专利文献 I: siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics (小干扰 RNA 用于基因治疗的研究进展）.Y. Dorsett，T. Tuschl，Nat. Rev. Drug Discovery (药物的发现）3 (2004) 318-329. 非专利文献 2:Evaluation of 29-modified oligonucleotides containing29-deoxy gaps as antisense inhibitors of gene expression(含有29-脱氧 空隙的29-改性寡聚核苷酸作为基因表达的反义阻遏剂的评价）.B. Monia，E. Lesnick，C. Gonzalez, W. Lima, D. McGee, C. Guinossoj A. Kawasaki, P. Cook, S. Freierj J. Biol. Chem. ( ^ 物化学）268 (1993) 14514-14522. 非专利文献 3:Potent gene-specific inhibitory properties of mixed-backbone antisense oligonucleotides comprised of 2'-deoxy-2J-fluoro-D-arabinose and2J-deoxyribose nucleotides (包括 -脱 氧-2' -氟代-D-阿拉伯糖和2' -脱氧核糖核苷酸的骨架混合的反义寡聚核苷酸的潜 在基因特异性阻遏性研究）.C. N. Lok，E. Viazovkine，K. L Min，C. J. Wilds，M. J. Damha，M. A. Parniak，Biochemistry (生物化学）41 (2002) 3457-3467. 非专利文献 4:2'-〇,4'-C-ethylene-bridged nucleic acids(ENA):highly nuclease-resistant and thermodynamically stable oligonucleotides for antise本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸复合物，其为单链DNA的3’侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3’位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5’侧末端的核糖核苷酸残基的5’位结合的核酸复合物，与所述单链DNA结合的所述核糖核苷酸链的5’侧末端核苷酸中的2’位的羟基被烷氧基或卤素原子置换。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.20 JP 2012-1392501. 一种核酸复合物，其为单链DM的3'侧末端的脱氧核糖核巧酸残基的3'位与双链 RNA中的一条核糖核巧酸链的5'侧末端的核糖核巧酸残基的5'位结合的核酸复合物，与所 述单链DNA结合的所述核糖核巧酸链的5'侧末端核巧酸中的2'位的哲基被烧氧基或面素 原子置换。2. -种核酸复合物，其为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核巧酸残基的3'位与双链 RNA中的一条核糖核巧酸链的5'侧末端的核糖核巧酸残基的5'位结合的核酸复合物，与所 述单链DNA结合的最初的核糖核巧酸的3'位与和其相邻的核糖核巧酸的5'位之间的磯酸 二醋基被硫代磯酸醋基、二硫代磯酸二醋基二硫代磯酸二醋基及=硫代磯酸二醋基中的任 一个置换。3. 根据权利要求1或2所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA的核巧酸数为10 W上。4. 根据权利要求1?3中的任一项所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA为聚脱氧腺 嚷岭。5. 根据权利要求1?4中的任一项所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA的磯酸二醋 基中的至少一部分被硫代磯酸醋基、二硫代磯酸二醋基及=硫代磯酸二醋基中的任一个置 换。6. 根据权利要求5所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA的磯酸二醋基中的至少 50% W上被硫代磯酸醋基、二硫代磯酸二醋基及=硫代磯酸二醋基中的任一个置换。7. 根据权利要求1?6中的任一项所述的核酸复合物，其中，所述双链RNA为siRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：樱井和朗，望月慎一，田中素子，樋口贞春，
申请(专利权)人：独立行政法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：日本;JP