本发明专利技术公开了一种以温度高效调控水相中酶促反应的方法，其特征是：合成智能高分子凝胶PNIPAM，并将该凝胶研磨成颗粒添加到海藻酸钠固载酶的催化体系中，以32℃为调控的分界温度，利用温度的小幅度变化，循环控制水相中酶促反应速率，实现对反应的“开”、“关”式调控。本发明专利技术实现了对水相中酶促反应的高效、灵敏、可循环的控制，解决了水相中酶促反应难于控制反应速率的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
随着工业及生物
的发展以生物酶为催化剂的酶促反应越来越多的应用 于工业及医药生产。酶促反应具有高效、专一、反应迅速等优点，同时由于生物酶活性的特 殊要求酶促反应多发生在水相体系中。然而正是因为酶促反应迅速的特点，水相中的酶促 反应很难控制其反应进程及速率，给研究酶促反应机理和大量酶促反应的工业投产带来了 一定的困难和危险。 现有的酶促反应调控方法多为宏观上单一的反应条件控制如：温度、pH的调节， 这些技术只能在宏观上微小的改变酶促反应的进程，并不能真正起到快速、有效控制反应 进行或停止的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题。相对于现有技术，本专利技术可以实现从微观 上迅速、简便的控制酶促反应的进行或停止。本专利技术通过在固载酶的体系中添加智能高分 子凝胶颗粒，在微观上利用智能高分子凝胶颗粒对于温度变化灵敏感应的收缩或膨胀来开 放或关闭酶与反应体系间的传质作用，就等同于在酶促反应中安装了温敏式开关，实现 了利用温度高效、灵敏的调控酶促反应速率的目的。 本专利技术第一步合成具有温度敏感效应的智能高分子凝胶PNIPAM，该种智能高分子 凝胶的响应温度为32°C，在32°C以上智能高分子凝胶PNIPAM在水中处于紧缩状态，其结构 塌缩；而在32°C以下智能高分子凝胶PNIPAM在水中处于舒展状态，其结构蓬松，并且以上 收缩及舒张的行为是可逆的。智能高分子凝胶PNIPAM的合成方法参考文献《PEG致孔快速 响应pH/温度双重敏感性PNIPAM/SA水凝胶的制备与性能》。 本专利技术第二步对PNIPAM凝胶冻干后研磨粉碎，其凝胶颗粒粒径在100-200微米 间。将该凝胶颗粒添加于酶的固载体系中。 本专利技术第三步实现酶的固载。将海藻酸钠溶于水中同时添加一定量的酶和PNIPAM 凝胶颗粒，混合均匀后将该悬浊液滴加与2%的氯化钙溶液中形成均匀固载有酶及智能高 分子PNIPAM凝胶颗粒的钙化海藻酸钠凝胶小球（其中海藻酸钠及酶均购于北京百灵威科 技有限公司）。将该固载体系冻干并适量添加于所需反应中。在该步骤中的优选条件为： 海藻酸钠与水的比例为：1 : 180-1 : 220 ;海藻酸钠与PNIPAM凝胶颗粒的比例 为：1 : 1-1 : 1.5;海藻酸钠与酶的比例为：1 : 0. 2-1 : 0. 3;冻干时间：8-12小时。 本专利技术第四步实现酶促反应的高效调控。将相应的固载有酶和PNIPAM凝胶颗粒 的催化体系应用于催化酶促反应中如：酯水解酶催化酯水解反应或手性拆分反应等。以 32°C为调控的分界温度分别在水相中试验酶促反应的反应速率。实验证明由于32°C以下 PNIPAM凝胶颗粒在水中处于舒展状态，其结构蓬松，堵塞了酶的活性中心位点并使水相反 应体系与酶的固载体系间的传质作用减弱，使得酶促反应速率大大降低从而抑制了酶促反 应的进行。而另一方面，32°C以上PNIPAM凝胶颗粒在水中处于紧缩状态，其结构塌缩，酶的 活性中心位点得以裸露并使水相反应体系与酶的固载体系间的传质作用增强，使得酶促反 应速率大大提高从而促进了酶促反应的进行。 而本专利技术的这一调控行为是可循环的，以32°C为调控的分界温度，利用温度小幅 度上下变化来控制水相中酶促反应速率，实现对反应的开、关式调控。 【附图说明】 附图1是本专利技术调控原理及方法的示意图。 注释：1_钙化海藻酸钠；2-智能高分子PNIPAM凝胶颗粒；3-紧缩状态下的智能高 分子PNIPAM凝胶颗粒；4-酶；5-在水中温度高于32°C ;6_在水中温度低于32°C 【具体实施方式】 第一步：PNIPAM的合成 将0. 94g的NIPAM单体、0. 06g的海藻酸钠和0. 02g的交联剂NMBA溶于4ml去离 子水中，加入〇.〇2g的PEG1000于上述溶液中，搅拌均匀；然后，加入0.02g的引发剂APS、 〇. 〇2g的促进剂TMEDA，密封烧杯，在室温下反应48h ;取出凝胶并切成薄片用去离子水浸泡 一周，定期换水以洗去PEG1000和未反应的单体。 第二步：制备PNIPAM凝胶颗粒 第一步制备完成后将凝胶冻干l〇h，取出后研磨成粉末粒径在100-200微米间。干 燥避光处保存以备后用。 第三步：酶的固载 将智能高分子PNIPAM与海藻酸钠混合，溶于去离子水中并充分搅拌。待体系搅 拌均匀后，加入液态酯水解酶，充分搅拌。以6号针头的一次性注射器吸出后不断滴加于 2%的CaCl 2溶液中，使其凝成直径为2-3mm的小球。将小球浸泡于2% CaCl2的溶液中 静置40分钟，以布氏漏斗抽滤并放于冻干机中冻干10小时。其中各原料比例为：海藻酸 钠 ：PNIPAM :去离子水：酯水解酶为I : 1 : 200 : 0· 2。 第四步：酶促反应的调控 本专利技术将结合说明书附图进一步说明 如说明书附图所示，在酶促反应中以本专利技术所示的方法以钙化海藻酸钠1包载智 能高分子PNIPAM凝胶颗粒2及酶4于催化体系中，在水中温度低于32°C (6)时智能高分子 PNIPAM凝胶颗粒2处于舒展状态，像门一样挡在酶4的外部从而抑制酶促反应的发生； 而在水中温度高于32°C (5)时智能高分子PNIPAM凝胶颗粒3处于紧缩状态，酶4的活性中 心位点得以裸露从而促进酶促反应的发生。这一调控作用具有对温度极为灵敏的响应性， 以实施例中标准化酯水解酶催化水解对硝基苯酚丁酸酯的反应为例说明，以反应产率衡量 其具体突变温度的实验数据列于表1。 另外本专利技术所示的方法，是可利用温度的小幅度变化，循环控制酶促反应速率的 方法。以实施例中标准化酯水解酶催化水解对硝基苯酚丁酸酯的反应为例说明，表2中的 实验数据以反应产率为衡量条件，展示出温度在30°C、35°C循环变化时本专利技术所示方法对 反应的开、关式调控。 下面的实施例将对本专利技术予以进一步说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例和 对比例中所得的实验结果列于表3,实施例和对比例中所用的海藻酸钠及酯水解酶均购于 北京百灵威科技有限公司。 实施例 本实施例选取标准化酯水解酶催化水解对硝基苯酚丁酸酯的反应，该反应具有反 应迅速、灵敏、产率较高等优点，可快捷的检测出本专利技术方法的调控效果。 取制备好冻干后的固载有酶、智能高分子凝胶颗粒的钙化海藻酸钠凝胶小球 0. 02g放置于20ml的烧杯中加入3ml去离子水，再取0. 06mmol对硝基苯酚丁酸酯滴入反应 体系中。将反应体系置于恒温水浴中反应，依所需条件不同调整反应温度，其中表1所示反 应温度分别为：20°C、25°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、40°C、45°C ;表 2 所示反应温 度分别为：l-30°C、2-35°C、3-30°C、4-35°C、5-3(rC、6-35°C ;表3所示实施例反应温度分别 为20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C。反应30min后停止，以紫外可见分光光度计分 析表征。紫外波段在311nm下的吸光度可作为水解产物对硝基苯酚的产率判断依据。 对比例 取制备好冻干后的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以温度高效调控水相中酶促反应的方法，其特征是，将合成的智能高分子PNIPAM凝胶冻干后研磨粉碎。
【技术特征摘要】
1. 一种以温度高效调控水相中酶促反应的方法，其特征是，将合成的智能高分子 PNIPAM凝胶冻干后研磨粉碎。2. 根据权利要求1所述的一种以温度高效调控水相中酶促反应的方法，其特征是，将 固载有酶及智能高分子PNIPAM...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓曦，
申请(专利权)人：杨晓曦，
类型：发明
国别省市：北京;11
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