维生素B6的酶促生产制造技术

一种维生素Ｂ＃－［６］的酶促生产方法，包括在ＮＡＤＰ＃＋［＋］、ＮＡＤ＃＋［＋］、ＡＴＰ的参与下，将１－脱氧－Ｄ－苏－戊酮糖和４－羟基－Ｌ－苏氨酸与从属于以下属的微生物细胞制备的酶反应体系一起温育，所述微生物属是根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Ｙａｍａｄａｚｍａ、毕赤酵母属和假丝酵母属。锰离子和镁离子促进上述反应。本方法提供高产量的为动物、植物和微生物营养所必需的并可用作药物或食品添加剂的维生素Ｂ＃－［６］。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从1-脱氧-D-苏-戊酮糖(此后表示为DTP)和4-羟基-L-苏氨酸(HT)酶促生产维生素B6的方法。本专利技术中所用的术语“维生素B6”包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。维生素B6是对于动物、植物和微生物营养必需的维生素之一。并且对于人类来说也是非常重要的药物或食品添加剂。本专利技术的目的是提供从DTP和HT酶促生产维生素B6的高效方法。已有很多关于维生素B6发酵生产的研究。已知各种属于酵母属、毕赤酵母属、克雷伯氏菌属、无色杆菌属、芽孢杆菌属和黄杆菌属的微生物用于生产维生素B6。但至今还没有商业上有吸引力的生产维生素B6的酶促方法。近来在欧洲专利公开0 765 938 A2中描述了一种发酵生产维生素B6的方法，该方法是在有氧条件下培养基中培养属于根瘤菌属能合成该维生素的微生物；其中培养基除了含有可吸收的碳源和可消化的氮源、无机盐及其它养分外，还含有提高维生素B6效价的其它物质如DTP和HT。虽然这种近来才知道的方法以高产率生产维生素B6，但是还有提高其效率的余地。本专利技术使得以比目前更高的效率从DTP和HT生产维生素B6成为可能。现已发现，从微生物细胞制备的无细胞提取物能在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的参与下从DTP和HT合成维生素B6，所述微生物是例如根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属或假丝酵母属。因此本专利技术涉及从DTP和HT酶促生产维生素B6的方法，包括使DTP和HT与从能由DTP和HT合成维生素B6的微生物细胞制备的酶反应体系接触，所述接触在NADP+、NAD+和ATP的参与下发生。本专利技术进一步涉及维生素B6的酶促生产方法，包括在NADP+、NAD+和ATP的参与下，使DTP和HT与含有来自能合成维生素B6的微生物的无细胞提取物的酶反应体系接触，所述能合成维生素B6的微生物是例如属于以下属的微生物根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属或假丝酵母属。反应混合物中维生素B6的含量可以按照D.R.Osborne和P.Voogt的方法〔食品中的养分析，Academic Press,London,224-227(1978)〕，用卡尔酵母ATCC 9080通过生物分析得到测定。为实施本专利技术的方法，属于例如根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属或假丝酵母属的微生物细胞可以通过在含有可吸收的碳源、可消化的氮源、无机盐和其它微生物生长必需养分的培养基中培养所述微生物得到。可以用作碳源的是例如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精和甘油。可用作氮源的是例如蛋白胨(peptone)、酵母提取物、豆粉、玉米浆、肉浸汁、硫酸铵、硝酸铵、尿素及以上物质的混合物。另外，可以用作无机盐的是硫酸盐；盐酸或磷酸的钙盐、镁盐、锌盐、锰盐、钴盐和铁盐。并且，如果需要，传统的营养素或消泡剂如动物油、菜油或矿物油也可以包含在培养基内。培养基的pH值可以是约5～9，优选的是约6～8。培养的适当温度范围是约10℃～45℃，优选的是25℃～40℃。培养时间通常是约1～5天，优选的是约1～3天。培养期间通风和搅拌通常带来有利的结果。能在本专利技术方法中使用的微生物包括所有属于以下属的菌株根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属和假丝酵母属。任何需要这些微生物的人可从公共保藏处(培养物保藏中心)如日本发酵研究所(IFO),Osaka得到。这些保藏菌株的例子是苜蓿根瘤菌(也称为苜蓿中华根瘤菌)IFO 14782(DSM号10226)，产吲哚黄杆菌(也称产吲哚金黄杆菌)IFO 14944，短乳杆菌IFO 13110，烟草节杆菌IFO 14234，枯草杆菌IFO 3007，植生克雷伯氏菌IFO 3317，大肠杆菌IFO 13168，恶臭假单胞菌IFO3738，嗜麦芽寡养单胞菌属(也称为嗜麦芽假单胞菌或嗜麦芽黄单胞菌)IFO 12692，阴沟肠杆菌IFO 3320，粘质沙雷氏菌IFO 12648，产氨棒杆菌(也称为产氨短杆菌)IFO 12612，谷氨酸棒杆菌(也称为谷氨酸短杆菌)IFO 12168，乙酰微小杆菌(也称为乙酰短杆菌)IFO 12146，季也蒙毕赤酵母(也称为Yamadazma guillermondii)IFO 1016，酿酒酵母IFO 0304和IFO 0306及热带假丝酵母IFO 0199和IFO 0587。在这些微生物中，本专利技术优选使用苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM号10226)，产吲哚黄杆菌IFO 14944，枯草杆菌IFO 3007，大肠杆菌IFO13168，粘质沙雷氏菌IFO 12648，产氨棒杆菌IFO 12612，谷氨酸棒杆菌IFO 12168，季也蒙毕赤酵母IFO 10106和酿酒酵母IFO 0306。从培养所获细胞制备无细胞提取物，可以采用一般的方法如声裂法、玻璃珠细胞破碎或弗氏压榨匀浆器(French press homogenizer)破裂细胞，如果需要，可以在上述方法破裂之前用细胞溶解酶如溶菌酶或消解酶在15℃～45℃，优选地20℃～40℃处理1～3小时。例如，培养液离心后，用盐水冲洗所得细胞并悬浮于缓冲剂如含有蔗糖、作为一般酶稳定剂的二硫苏糖醇(DTT)和苯甲基磺酰氟(PMSF)的Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)中。细胞破裂后，将所得溶液离心以分离细胞残渣，其上清液可以用作无细胞提取物。酶反应体系含有如上制备的无细胞提取物或那些通过一般的酶纯化方法如硫酸铵沉淀或凝胶过滤层析部分纯化的物质。选择性地，也可以使用微生物的静止细胞或正在生长的细胞。除了可加入无细胞提取物，还可向酶反应体系加入作为酶底物的DTP和HT和作为辅因子的NADP+、NAD+和ATP。加入体系的DTP、HT、NADP+、NAD+和ATP的量可以根据所用的反应体系来改变。但是通常酶反应体系中的DTP、HT、NADP+、NAD+和ATP的量是0.1mM或更多，对于DTP和HT优选1mM～10mM，对于NADP+和NAD+优选0.05mM～5mM，更优选0.2mM～0.4mM，对于ATP优选1mM～20mM，更优选3mM～7mM。酶反应体系中镁离子或锰离子的加入可促进反应，并且同时加入这两种离子可得到更好的结果。可以使用提供这些离子的盐类如镁和锰的盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐。所加入的镁离子和锰离子的量也可以根据所用的反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
从１－脱氧－Ｄ－苏－戊酮糖（ＤＴＰ）和４－羟基－Ｌ－苏氨酸（ＨＴ）生产维生素Ｂ↓［６］的方法，此方法包括使ＤＴＰ和ＨＴ与从能由ＤＴＰ和ＨＴ合成维生素Ｂ↓［６］的微生物细胞制备的酶反应体系接触，于是在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰ↑［＋］）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ↑［＋］）和腺嘌呤核苷三磷酸（ＡＴＰ）存在的情况下发生所述的接触。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T星野，M田添，
申请(专利权)人：DSMIP资产有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]