一种用于递呈生长因子的类糖胺聚糖纳米粒子的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于递呈生长因子的类糖胺聚糖纳米粒子的制备方法。其以糖胺聚糖中的主要成分透明质酸为基础，经硫酸化修饰后通过静电结合与带正电荷的壳聚糖作用形成表面带负电荷的纳米粒子，模拟细胞外基质中生长因子的存在形式，将FGF-2稳定结合在类糖胺聚糖纳米粒子的硫酸化基团上，从而达到提高生长因子稳定性和缓释的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于递呈生长因子的类糖胺聚糖纳米粒子的制备方法。
技术介绍
众所周知，细胞因子在细胞增殖、分化、迁移以及一些代谢途径中发挥着重要的作用。在临床上细胞因子已被用于创伤修复、骨疾病等，但由于生长因子存在体内半衰期短，清除率高，生物利用度低等缺点，限制了细胞因子在神经、血管、软骨等组织工程中的应用。为此，为了更好地发挥细胞因子在再生医学中的作用，解决生长因子的稳定性和递呈性是目前关注的重点。载药纳米技术利用其缓释性、靶向性可提高药物的作用效果。纳米载药系统作为新型的药物投递和控制释放系统，受到国外学者的广泛关注。控制纳米微粒的大小，可以使纳米微粒到达特定的部位，起到靶向作用。通过控制纳米粒子的降解可以控制药物释放，延长药物的作用时间，可以提高药物的稳定性，避免药物在到达受体部位前被降解。聚合物形成的纳米粒子能够达到保护生长因子免受酶降解，同时使其缓慢释放的目的。研究表明，葡聚糖和明胶形成的纳米粒子能将生长因子递呈至小鼠间充质干细胞，并使细胞维持十天之久的活力。另有研究表明，硫酸化壳聚糖和未修饰的壳聚糖组成的纳米粒子也能达到生长因子向成纤维细胞的递呈作用。而在正常组织中，生长因子往往被贮存于细胞外基质中，通过与糖胺聚糖中的硫酸乙酰肝素糖链结合而达到稳定存储及信号传导的作用。因此采用类糖胺聚糖的纳米粒子装载生长因子有可能改善生长因子在血浆中的稳定性以及达到缓释作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于递呈生长因子的类糖胺聚糖纳米粒子的制备方法。本专利技术的技术方案为：以糖胺聚糖中的主要成分透明质酸为基础，经硫酸化修饰后通过静电结合与带正电荷的壳聚糖作用形成表面带负电荷的纳米粒子，模拟细胞外基质中生长因子的存在形式，将FGF-2稳定结合在类糖胺聚糖纳米粒子的硫酸化基团上，从而达到提高生长因子稳定性和缓释的目的。本专利技术提出的用于递呈生长因子的类糖胺聚糖纳米粒子的制备方法的具体操作步骤如下：从透明质酸出发，经硫酸化修饰得到携带负电荷的透明质酸衍生物，超过量的硫酸化透明质酸与一定量的富含正电荷的壳聚糖充分搅拌，经静电结合作用后，取上清离心得到类糖胺聚糖纳米粒子，将一定量生长因子FGF-2加入上述类糖胺聚糖纳米粒子水溶液中，使生长因子结合于类糖胺聚糖纳米粒子表面的糖链上，形成载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子，从而实现生长因子的稳定递呈和缓慢释放。本专利技术的独到之处有两点：首先，通过静电作用将带负电荷的硫酸化透明质酸与带正电荷的壳聚糖相互作用形成表面带负电荷的纳米粒子，其表面的糖链结构类似于细胞外基质中的硫酸乙酰肝素糖链；其次，模拟细胞外基质中生长因子的存在形式，将FGF-2稳定结合在类糖胺聚糖纳米粒子表面的糖链上，在细胞周围形成一个稳定且持续的高浓度生长因子环境。具体实施方式以下利用实施例进一步详细说明本专利技术，但不能认为是限定专利技术的范围。实施例一：硫酸化透明质酸的制备1g透明质酸溶解于100mL 2M NaOH中，在氮气保护下60℃反应24小时，反应结束后冷却至室温，用HCl调节pH为7，透析冻干得到脱乙酰化透明质酸。将脱乙酰化透明质酸溶液经过强酸型苯乙烯系阳离子交换树脂短柱，流出液用四丁基氢氧化铵溶液中和，冻干得白色粉末。将2g上述白色粉末溶于40mL DMF中，加入100mg DMF–SO3复合物剧烈搅拌，4℃反应24小时。加入等体积冷水结束反应，用2M NaOH调节pH至7.5，乙醇洗涤沉淀，用超纯水作为透析液，截流分子量为12000的透析袋透析，冻干后得到硫酸化透明质酸。实施例二：类糖胺聚糖纳米粒子的制备分别将硫酸化透明质酸和壳聚糖溶于0.1M醋酸缓冲液(pH 5.0)中，经0.22μm PVDF滤膜过滤，得终浓度分别为1.0mg/mL和0.9mg/mL的溶液。取5mL壳聚糖溶液在剧烈搅拌下一次性加入35mL硫酸化透明质酸溶液中，反应3小时后静置过夜，取上清10000rcf离心15分钟，弃去上清将沉淀用去离子水复溶即得以硫酸化透明质酸和壳聚糖为基础的类糖胺聚糖纳米粒子，测得其流体力学半径为255nm，Zeta-电位为-40mV。实施例三：载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子的制备取5μg生长因子FGF-2加入5mL上述类糖胺聚糖纳米粒子水溶液(1.0mg/mL)中，在4℃，800r/min电磁搅拌的条件下充分反应60分钟，然后10000rcf离心、蒸馏水洗涤、冷冻抽干，得到固化的载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子，测得其流体力学半径为255nm，Zeta-电位为-3.5mV。实施例四：载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子载药率和包封率的测定收集制备载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子过程中所有弃液，用ELISA法测定其中FGF-2的含量，并用冷冻抽干法得到弃液中残留的纳米粒子的量。计算载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子的质量，以及其中FGF-2的含量。测定得到类糖胺聚糖纳米粒子载药率为0.08％，包封率为70.31％。实施例五：载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子体外释药取一系列载药纳米粒子，每份1mg，分别装入1.5mL离心管中，加入1mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液；将离心管放在37℃的水浴恒温振荡器内(频率60r/min)，间隔一段时间取出一个离心管离心沉淀(10000rcf)载药纳米粒子，将上清液和沉淀分别收集。用ELISA法检测上清液中FGF-2的含量，并用冷冻抽干机冷冻干燥释放后的纳米粒子并精确称重。经绘制的载药释放曲线得知，生长因子在前3小时有突释现象，从第2开始进入稳定释放阶段，FGF-2每天的释放量基本维持平衡。实施例六：载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳米粒子对间充质干细胞生长的影响将载药纳米粒子、空纳米粒子、FGF-2分别作用于间充质干细胞，培养0、3、7、14天后采用CCK-8体外细胞增殖检测试剂盒检测间充质干细胞的活力。体外培养第1天，细胞活力差异无显著性，培养3～14d，载药纳米粒子组细胞活力明显高于普通培养组，可能是载药纳米粒子在细胞周围形成一个稳定且持续的高浓度生长因子环境相关。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于递呈生长因子的类糖胺聚糖纳米粒子的制备方法，是从透明质酸出发，经硫酸化修饰得到携带负电荷的透明质酸衍生物，超过量的硫酸化透明质酸与一定量富含正电荷的壳聚糖充分搅拌，经静电结合作用后，取上清离心得到类糖胺聚糖纳米粒子，将一定量生长因子FGF‑2加入上述类糖胺聚糖纳米粒子水溶液中，使生长因子结合于类糖胺聚糖纳米粒子表面的糖链上，形成载生长因子FGF‑2的类糖胺聚糖纳米粒子，从而实现生长因子的稳定递呈和缓慢释放。

【技术特征摘要】
1.一种用于递呈生长因子的类糖胺聚糖纳米粒子的制备方法，是从透明质酸出发，经硫酸化修饰得到携
带负电荷的透明质酸衍生物，超过量的硫酸化透明质酸与一定量富含正电荷的壳聚糖充分搅拌，经静电结
合作用后，取上清离心得到类糖胺聚糖纳米粒子，将一定量生长因子FGF-2加入上述类糖胺聚糖纳米粒子
水溶液中，使生长因子结合于类糖胺聚糖纳米粒子表面的糖链上，形成载生长因子FGF-2的类糖胺聚糖纳
米粒子，从而实现生长因子的稳定递呈和缓慢释放。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将1g透明质酸溶解于100mL 2M NaOH中，在氮气保护
下60℃反应24小时，反应结束后冷却至室温，用HCl调节pH为7，透析冻干得到脱乙酰化透明质酸，将
脱乙酰化透明质酸溶液经过强酸型苯乙烯系阳离子交换树脂短柱，流出液用四丁基氢氧化铵溶液中和，冻
干得白色粉末，将2g白色粉末溶于40mL DMF中，加入100mg DMF–SO3复合物剧烈搅拌，4℃反应24
小时，反应结束用2M NaOH调节pH至7.5，乙醇洗涤沉淀...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕丽萍，付海田，王敏，陈敬华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32