本发明专利技术公开了利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物，包括：(1)检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针；(2)检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针。利用本发明专利技术的引物，通过对病毒RNA抽提，逆转录和实时荧光定量PCR，可检测H7N9禽流感病毒，具有高准确性，高敏感性，高特异性和短检测窗口期等优点，可为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。
【技术实现步骤摘要】
—种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物及方法本申请是申请号为201310129302.4、申请日2013年4月12日的中国专利申请的分案申请。
本专利技术属生命科学和生物
，特别是一种用于检测H7N9禽流感病毒的试剂盒。
技术介绍
流感病毒属于正粘病毒科(orthomyxoviridae),有包膜、分节段基因组的单负链RNA病毒。根据核蛋白和包膜内侧面的Ml蛋白的抗原性将流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒再根据包膜表面血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase, NA)两种刺突的抗原性分若干亚型，目前包括Hl?H16亚型，NA包括NI?N9亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。H3为人犬共患，依据流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种。这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。 H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。但我国人感染H7N9禽流感于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，并且至2013年4月初尚未有疫苗推出。 中国国家卫生和计划生育委员会2013年3月3日印发人感染H7N9禽流感诊疗方案、防控方案及医院感染预防与控制技术指南。根据人感染H7N9禽流感诊疗方案(2013年第I版)，人感染H7N9禽流感传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。传播途径为经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。现阶段高危人群主要是从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前I周内接触过禽类者。诊疗方案指出，人感染H7N9禽流感潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39°C以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。 根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人感染H7N9禽流感的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果，特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，可以诊断。
技术实现思路
鉴于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。本专利技术提供了一种实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，用于检测H7N9禽流感病毒核酸。 一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:(1)RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂；(2)用于扩增样本cDNA的引物及探针，包括:检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针: H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针: N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。 进一步地,所述RNA提取试剂包括QIAamp Viral RNA mini Kit ;所述逆转录试剂包括 5 X RT-Buffer, 10uM Primer Mix, 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶和 DEPC 水；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括qPCR Mix，50 X R0X，扩增引物及探针和灭菌水。 更进一步地，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤:(1)用RNA提取试剂提取呼吸道标本的RNA；(2)用逆转录试剂将步骤(I)中得到的RNA进行反转录为cDNA; (3)使用弓I物H7-F、H7-R和N9_F、N9_R及相应探针H7-probe、N9_probe在单管PCR反应体系中对步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测。 其中，实时荧光定量PCR反应程序:95°C 1min预变性；95°C 15sec，58°C35sec，39个循环。 步骤⑴的具体抽取步骤如下: I)吸取560ul准备好的buffer AVL (含有carrier RNA)到1.5ml离心管中。(根据样品的实际量按比例调整buffer AVL-carrier RNA)。 2)将140ul血浆，血清，尿液，培养细胞上清液或是无细胞体液加入到装有bufferAVL-carrier RNA的离心管中。斡旋15秒，混匀。(为保证裂解效率，一定要彻底混匀，形成均一溶液。只溶解过一次的样品也仍然可用)。 3)室温放置lOmin。( 10分钟足够，延长时间不会增加产物质量。Buffer AVL可以使潜在的污染和Rnase失活)。 4)瞬时尚心,将盖子上的液滴甩回管底。 5)样品中加入560ul无水乙醇(96%?100%)，斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底。(只可以用乙醇，因为其他酒精会降低产量和纯度。不能使用变性酒精，因为其中含有其他物质。如果样品量大于140ul，按比例增加乙醇的量。该步骤要充分混匀，形成均一溶液，以保证产量)。 6)吸取630ul上步中的溶液小心的加入column(已装入到2ml离心管中)中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000Xg (8000rpm)离心lmin。将column放入新的2ml离心管中，弃去旧的收集管。(每一个column都要盖上，以防交叉污染。SOOOrpm的速度是为了限制噪音，全速离心也是可以的，不会影响产物。如果溶液没有完全透过膜，可以更高的速度再次离心，直到溶液完全透过)。 7)小心的打开column的盖子，重复第6步。(如果样品量超过了 140ul，那么重复此步骤，直到所有的裂解液都上柱)。 8)小心的打开column盖子，加入500ul buffer Affl0盖上盖子，8000rpm离心，lmin。将column放入新的2ml收集管(Kit提供)中，弃去旧的收集管。(即使样品量大于140ul，也无需增加buffer Affl的量)。 9)小心的打开column盖子，加入500ul buffer AW2。盖上盖子，全速离心(14000rpm), 3min0接着进行第11步，或者先进行第10步，以避免b本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物，其特征在于，所述引物包括：(1) 检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针：H7‑F: GGGWTTCACMTACAGYGGAATAAGH7‑R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGCH7‑probe: FAM‑CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGWTCTTC‑TAMARA；(2) 检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针：N9‑F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9‑R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGAN9‑Probe: HEX‑CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA‑TAMARA。
【技术特征摘要】
1.一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物，其特征在于，所述引物包括: (1)检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针:H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGCH7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA ； (2)检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针:N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGAN9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。2.利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的方法，其特征在于，所述包括以下步骤: (1)用RNA提取试剂提取呼吸道标本的RNA； (2)用逆转录试剂将步...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈奕磊，李文静，王淑一，黎飒，徐建成，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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