本发明专利技术公开了一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明专利技术还公开了该基因启动子在盐胁迫下提高报告基因在拟南芥和大豆中的表达的应用。实验证明，在盐诱导下，本发明专利技术所述的启动子能上调驱动报告基因在转基因拟南芥和大豆原生质体中的表达，此为GmNAC4基因耐盐调控机制研究，为获得通用型的盐诱导型启动子提供了序列材料，也为其用于培育抗盐作物品种提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子
本专利技术涉及一种启动子，尤其涉及一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子。
技术介绍
大豆(Glycinemax.)含有丰富的植物蛋白、脂肪和多种对人体有益的活性物质，是重要的蛋白质、油脂及保健品活性物质的重要来源，同时是食品、饲料等多种加工工业的优质原料，在国民经济中处于重要的地位。大豆，豆科(Fabaceae)，大豆属(Glycine)，属于淡土植物，耐盐性较差，土地高盐碱含量限制了大豆种植业的发展(王遵亲等，1993)。转录因子通过与下游基因启动子上的顺式作用相互作用调节基因的表达模式，参与生物体的各项生理活动，转录因子的研究对掌握生物体整个调控网络有重要意义，植物转录因子研究是功能基因组研究的一个重要方面。1997年Aida等首先报道了NAC结构域，发现在矮牵牛NAM基因、拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码蛋白的N端包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为NAC(Aidaetal.,1997)。后来在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中又相继发现多种NAC转录因子。目前在拟南芥中共发现了105个NAC成员，而水稻中则发现了75个(Ookaetal.,2003)。研究表明，NAC转录因子在植物的生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发挥着重要作用。2010年大豆全基因组测序以来，与胁迫相关的大豆NAC转录因子的研究越来越多，一些大豆NAC转录因子参与到干旱、盐、渗透胁迫响应和应答过程，在大豆的抗逆过程中起作用。LucianoG.Fietto2009发现GmNAC2、GmNAC3、GmNAC4对渗透压胁迫强烈响应，GmNAC3和GmNAC4对ABA、盐及JA响应。利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的抗逆相关启动子的发现、克隆、顺式作用元件分析以及与顺式元件相互作用的转录因子的研究仍然是今后研究的重点，将功能明确的抗逆启动子成功应用到转基因植物中调控抗逆基因的表达是植物抗逆基因工程的研究方向。NAC家族中逆境相关基因往往对多种逆境胁迫响应，这大部分归功与基因启动上含有多种逆境胁迫相关的顺式作用元件，通过对逆境相关的NAC家族基因启动子研究可以得到多种与胁迫相关的关键DNA片段和顺式作用元件，对构建有效的逆境诱导型启动子有重要意义。目前研究较深入的有：脱落酸响应元件(ABA-responsiveelement,ABRE)、乙烯响应元件(ethylene-responsiveelement,ERE)、茉莉酸类物质应答元件(jasmonate-responsiveelement,JRE)、低温响应元件(low-tempraturereponsiveelement,LTRE)和干旱应答元件(dehydration-responsiveelement,DRE)等。(朱丽萍,于壮,等.植物逆境相关启动子及功能.遗传.2010,32(3):229-234)对植物启动子的研究有助与了解基因转录调控表达模式和其调控机制，且对特异性及诱导性启动子的研究，有助得到正常高效的转基因植物。本实验室前期工作中已经证明来源于耐盐品种——圣豆9号的GmNAC4基因为盐响应基因，且对盐胁迫为正调节作用(专利CN102660554A)。通过比较耐盐大豆圣豆9号在盐和非盐条件下的基因表达谱变化，发现了GmNAC4基因在盐处理下上调表达，将该基因的过表达载体转入模式生物拟南芥中，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的提高抗盐/耐旱性的能力。通过大豆萌动胚真空渗透辅助的外源基因转化方法将该基因的过表达载体转入大豆中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的抗盐/耐旱性显著地提高。然而，GmNAC4基因的上游调控基因和参与的信号通路并不明确，研究GmNAC4基因盐诱导启动子可以帮助更好地阐释GmNAC4基因的功能，同时研究GmNAC4的盐诱导特性可为获得通用型的盐诱导型启动子提供重要参考，将来可用于转基因耐盐作物的培育。经过检索，未见有关于GmNAC4基因盐诱导启动子的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子及其应用。本专利技术所述的大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：a)序列表中SEQIDNo:1的DNA序列；b)与序列表中SEQIDNo:1的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。本专利技术还提供了一种含上述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子的报告基因GUS表达载体pGmNAC4::pKGWFS7；以及含上述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子的报告基因LUC表达载体pGmNAC4::pGreenII-0800LUC。本专利技术所述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子受盐胁迫诱导高效启动目标基因表达的应用。本专利技术首先在大豆圣豆9号植株中克隆到了GmNAC4基因启动子；利用Gateway系统，经过BP、LR反应，将GmNAC4基因启动子连接到GUS报告基因表达载体pKGWFS7(见图2)上；将pGmNAC4::pKGWFS7载体转入农杆菌菌株GV3101中，通过转化的农杆菌菌株转入模式植物拟南芥中，以验证GmNAC4基因启动子功能。本专利技术还通过酶切连接将GmNAC4基因启动子连接到pGreenII-0800LUC载体中，通过拟南芥和大豆叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，验证GmNAC4基因启动子受盐诱导的功能。实验证实：本专利技术所述圣豆9号GmNAC4基因启动子能够在盐诱导条件下上调目标基因的表达，可望用于转基因耐盐植物的培育。其中：所述植物优选大豆或拟南芥。本专利技术有益效果体现在：利用PCR克隆技术，本专利技术首次克隆得到了大豆圣豆9号GmNAC4基因启动子，并驱动GUS报告基因在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备表达GUS基因的能力，且在盐诱导条件下能更高地表达。通过拟南芥和大豆叶肉细胞原生质体瞬时转染体系，经过比较分析证明，转基因拟南芥和大豆原生质体能在盐诱导下较非盐条件下能更高效的表达报告基因。预示本专利技术所述的基因可广泛用于培育抗盐的植物品种。附图说明图1为PCR克隆大豆圣豆9号GmNAC4基因启动子电泳图，其中：M为Marker，泳道1、2、3为启动子DNA。图2为pKGWFS7.0载体示意图。图3为GmNAC4::GUS转基因拟南芥GUS染色结果，其中,A为转基因拟南芥全株的染色结果，在根、根尖、侧根起始部位、气孔有GUS信号，B为根部，C为根尖，D为侧根起始部位，E为气孔。图4为GmNAC4::GUS转基因拟南芥在盐和非盐条件下GUS染色对比图，(盐处理下在转基因拟南芥中根部的GUS信号增强)其中，MOCK为转基因拟南芥正常培养6h对照，NaCl为150mMNaCl处理6h。图5为pGreenII-0800LUC载体T-DNA插入区示意图。图6为GmNAC4启动子在盐和非盐条件下相对荧光素酶测定结果，其中，MOCK为转化原生质体正常培养6h的相对荧光素酶活性，NaCl为转化原生质体150本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：a)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列；b)与序列表中SEQ ID No:1的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。2.含有权利要求1所述大豆圣豆9号GmNAC4基因盐诱导启动子的报告基因G...
【专利技术属性】
技术研发人员：向凤宁，杨丹，宋显伟，李朔，刘振华，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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