miR-7及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种miR-7及其应用。本发明专利技术通过三维胶原海绵支架培养细胞体系发现miR-7通过调控Klf4基因进而促进神经干细胞分化，从而筛选到miR-7。在神经干细胞内过表达或敲低miR-7，进一步证实miR-7具有促进神经干细胞定向分化为神经元的功能。

【技术实现步骤摘要】
miR-7及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种miRNA及其应用。
技术介绍
当今颅脑和脊髓外伤、脑血管疾病、神经系统先天性疾病和罹患神经退变性疾病人数急剧上升，人类一旦发生脑出血、脑梗塞、脑外伤、脊髓损伤等疾病后，损伤的神经功能难以自我修复，多遗留严重的后遗症。神经干细胞作为一种具备自我更新能力及多向分化潜能的细胞,它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。神经干细胞为神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径，具有广泛的临床应用前景。寻找促进神经干细胞分化的因素对于组织再生、神经系统退行性疾病、脑外伤以及脑肿瘤的发生、发展和治疗有着非常重要的意义，许多研究发现小分子化合物AICAR、生长因子FGF，生物材料石墨烯等具有促进神经元分化的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种miRNA及其应用，所述miRNA命名为miR-7。本专利技术提供的miRNA具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQID№.1所示的核苷酸序列；2）与1）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。所述参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新，具体指所述miRNA是通过调控其下游基因Klf4的表达来参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新。所述参与神经干细胞的分化，具体指所述miRNA促进所述神经干细胞的分化。所述参与神经干细胞的自我更新，具体指所述miRNA抑制所述神经干细胞的自我更新。所述神经干细胞具体为大鼠神经干细胞。本专利技术的另一个目的是提供所述miRNA在制备具有下述任意一种功能的产品中的应用：1）调节神经干细胞的分化；2）调节神经干细胞的自我更新；3）调节神经干细胞的全能性。所述调节神经干细胞的分化为促进神经干细胞的分化；所述调节神经干细胞的自我更新为抑制神经干细胞的自我更新；所述调节神经干细胞的全能性为抑制神经干细胞的全能性。所述应用中，所述促进神经干细胞分化具体指促进神经干细胞分化为神经元。本专利技术的另一个目的是提供所述的miRNA在制备具有调控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tuj1基因表达功能产品中的应用。具体的，所述调控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tuj1基因表达指抑制Klf4、Nestin和/或Vimentin基因的表达；和/或促进Map2和/或Tuj1基因的表达。本专利技术的再一个目的是提供一种筛选所述miRNA的方法，所述方法包括以下步骤：1）将全能干细胞分别在二维培养体系或三维胶原海绵培养体系中培养；2）分析miRNA在步骤1）所述的两个培养体系中培养的全能干细胞中的表达差异；3）选取表达差异达到统计学显著水平的miRNA进行分离、测序即得。所述步骤1）中，所述三维胶原海绵培养体系具体指以胶原海绵为三维支架的培养体系。所述胶原海绵购自美国美敦力公司（MedtronicSofamorDanekUSA,Inc）。所述方法中，所述全能干细胞具体为PA-1细胞或神经干细胞。所述方法中，所述二维培养体系具体指常规的单层细胞平面培养体系。本专利技术通过三维胶原海绵支架培养细胞体系筛选到miR-7，miR-7通过调控Klf4基因进而促进神经干细胞分化，进而通过在神经干细胞内过表达或敲低miR-7，检测miR-7表达情况对神经干细胞分化的影响，进一步证实miR-7具有促进神经干细胞定向分化为神经元的功能。附图说明图1为三维培养体系中表达下调的miRNA与PA-1细胞自我更新调控关键基因的调控网络图。图2为Real-timePCR方法检测miR-7在三维培养体系（3D）或二维培养体系(2D)培养的PA-1细胞内的表达情况，其中**表示P<0.01。图3为Real-timePCR方法检测三维培养体系（3D）或二维培养体系(2D)内大鼠神经干细胞自我更新及分化相关基因的表达情况，其中**表示P<0.01。图4为Real-timePCR方法检测三维培养体系（3-D）和二维培养体系(2-D)内大鼠神经干细胞中miR-7（图4A）和Klf4基因（图4B）的表达情况。图5为Real-timePCR方法检测过表达miR-7或敲低miR-7表达后，神经干细胞自我更新相关基因Nestin、Sox2、Vimentin和分化相关基因Tuj1、Map2的表达情况，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01。图6为免疫荧光检测过表达miR-7或敲低miR-7表达后，神经干细胞自我更新相关基因Nestin（图6A），Sox2（图6B），Vimentin（图6C）和分化相关基因Tuj1（图6D），Map2（图6E）,的表达情况，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中如无特殊说明，所述液体与液体的比值为体积与体积比或体积百分含量；所述液体与固体的比值为体积与质量比；所述固体与固体的比值为质量与质量比或质量百分含量。胶原海绵购自美国美敦力公司（MedtronicSofamorDanekUSA,Inc）实施例1、以胶原海绵为支架的三维培养体系培养细胞（一）细胞的二维培养PA-1细胞的二维培养：PA-1细胞购自中国协和医科大学基础医学院，为ATCC细胞库收录(CRL-1572TM)。于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中无菌培养(ThermoForma公司)。培养基为高糖DMEM（Hyclone），含体积百分比为10%的胎牛血清（Gibco）、青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml，在37℃、5%CO2培养箱中培养，隔日传代。细胞传代时用0.25%的胰蛋白酶进行消化。大鼠神经干细胞的分离与二维培养：取8只SD乳鼠（出生12小时以内的乳鼠）（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），在75%酒精中浸泡处死，在超净台内断头，取出端脑，将端脑转移至预冷的含糖PBS（内含0.1M葡萄糖）中，仔细地剔除血管和脑膜，在预冷的含糖PBS中洗3次，将PBS吸干，弯剪剪碎脑组织，将组织转移至15ml离心管，加0.25%胰酶，37℃消化40分钟，消化20分钟时拿出来吹打一次，消化40分钟后用胰酶抑制剂终止消化，加基础培养基，吹散沉淀，注意尽量不要产生气泡，200目细胞筛过滤后，500g离心5分钟，去掉上清，加入添加有B27、20ng/mlbFGF和20ng/mlEGF的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中悬浮培养，培养3天后换液，继续培养至7天，形成直径100-200μm的神经球。将含神经球的悬浮培养基倒入离心管中，250g离心5分钟，去掉上清，收集沉淀。加入0.25%胰酶消化，室温孵育15-20分钟，在第8分钟时，轻轻将沉底的细胞团块吹散，继续孵育，孵育至20分钟后，用含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止胰酶作用，显微镜下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种miRNA，所述miRNA具有下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID№.1所示的核苷酸序列；2）与1）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。

【技术特征摘要】
1.miRNA在制备具有调控Map2和/或Tuj1基因表达功能产品中...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔熠，肖志峰，魏建树，陈冰，陈同，戴建武，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11