信使RNA的肺递送制造技术

本发明专利技术公开了一种用于在肺中表达mRNA的方法，其中-将待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)组合来提供包含mRNA和PEI的组合；-将包含mRNA和PEI的组合施用至肺，在肺中所述组合进入肺细胞；以及-在肺细胞中表达mRNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】信使RNA的肺递送
本专利技术涉及一种用于在肺中表达mRNA的方法。
技术介绍
信使RNA(mRNA)是由主要以腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷为核苷的核苷磷酸构建模块所构建起来的聚合物，信使RNA作为中间载体从细胞核中的DNA携带遗传信息到细胞质中，在细胞质中它被翻译成蛋白。因此，它们适合作为用于基因表达的替代品。细胞中生化过程的澄清和人类基因组的澄清，已经揭示了基因缺乏与疾病之间的关系。因此，长期以来希望通过基因疗法治愈基因缺乏所导致的疾病。期待很高，但就此方面的最初尝试失败了并且只报道了最近的进展。基因疗法的第一种方法在于在载体中将缺乏的或缺陷的(defective)基因的完整DNA带到细胞核中以实现完整基因的表达，由此提供缺失或有缺陷的蛋白。这些尝试大部分都没有成功，不太成功的尝试压力在于实质性的副作用，特别是提高的肿瘤发生。只是最近报道了更有希望的结果，然而距离获得批准还相差甚远。此外，还有一些疾病是由于缺乏蛋白或蛋白的缺陷，而缺乏这些蛋白归因于遗传缺陷。在这样的情况下，也考虑通过施用DNA来体内产生相关的蛋白。也可以通过零或低副作用的核酸疗法，提供在代谢中发挥作用并且出于病理或非病理的原因而被破坏或抑制的因子。还已提出了使用mRNA用于遗传病的疗法以便治疗导致疾病的基因缺陷。这方面的优势在于仅需要将mRNA引入细胞的细胞质，而不需要转位至核中。转位至核中是困难且低效的；而且如果载体或其部分被并入基因组中的话，存在相当大的改变染色体DNA的风险。诚然，能够证明体外转录的信使RNA其实也可以表达于哺乳动物组织中，然而在尝试使用mRNA用于疾病疗法中出现了进一步的障碍。mRNA的稳定性缺乏有这样的影响，即期望的蛋白不能在哺乳动物组织中以足够的量获得。mRNA触发大量免疫反应的事实导致了另一实质性缺点。据推测，通过结合到Toll样受体如TLR3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-1，产生这些强烈的免疫反应。为了防止免疫反应，在WO2007/024708A中提议使用这样的RNA，即在RNA中四个核糖核苷酸中的一个被替换为修饰的核苷酸。特别是，研究了当尿苷完全由假尿苷取代时，mRNA的行为如何。已经发现，这样的RNA分子免疫原性显著更低。此外，还提出了使用具有编码蛋白或蛋白片段的序列的RNA，其中RNA含有未修饰的和修饰的核苷酸的组合，其中5至50％的尿苷核苷酸以及5至50％的胞苷核苷酸分别是修饰的尿苷核苷酸和修饰的胞苷核苷酸。已经发现，这样的RNA分子免疫原性显著更低，甚至更稳定。还提出，通过在小鼠中气管内气雾的重复应用，这样的RNA可用于预防患有表面活性剂蛋白B(SP-B)缺乏症的小鼠死亡。这些观察从而证明这种RNA有希望来治疗威胁生命的遗传性和获得性肺疾病，并解决远远没有得到满足的医疗需求。然而，考虑到在患者中进行应用，由于需要进行麻醉并且使用临床上标准使用的雾化器所导致的RNA降解，这种应用程序还不适合重复的气雾应用。为了能够利用RNA给身体的肺提供必要的或有益的蛋白和/或治疗由于缺失的或缺乏的蛋白所导致的疾病，希望可获得这样一种方法用于重复的气雾应用，其避免重复麻醉患者。然而，同时这种方法不应导致显著程度的RNA功效降低。在EP1173224B1中，提出使用聚乙烯亚胺(PEI)25kDa/DNA制剂用于向肺进行基因的气雾递送，相较于体外转染，这适于克服先前未解决的雾化过程中伴随的重复麻醉和功效显著降低的问题。人们发现，PEI/DNA制剂耐受喷射雾化器(jet-nebulizer)诱导的转染效率降低，并且当通过喷射雾化器体内递送时，优于以前优化的基于脂质的制剂。具体地，EP1173224B1公开了一种靶向疗法(如经由呼吸道的基因疗法)的方法，其包括经由个体呼吸道通过小颗粒气雾递送复合有聚乙烯亚胺的遗传大分子的水性分散剂的步骤。根据该专利技术方法有代表性的遗传大分子的实例包括DNA、RNA和其它核酸种类。然而，该专利技术被缩减到仅仅在专利所含实施例中实施用于DNA的递送，而非用于mRNA。此外，通过将溶于水的质粒DNA和适当量的溶于PBS的PEI进行混合，形成编码兴趣基因的质粒DNA与PEI的复合物。然而，Rudolph等人(MolTher.2005,12:493-501)表明当在低渗蒸馏水中组装和雾化时，PEI-DNA复合物在小鼠肺中分别产生比在等渗5％葡萄糖或Hepes缓冲盐水中57-和185-倍高的表达水平。令人惊奇地，当在PBS中组装和雾化时，PEI-DNA复合物完全无效。这主要归因于以下事实：PBS中配制的PEI基因载体产生大的直径(848±142nm)，这在动力学上是不稳定的，并导致沉淀。也发现，复合至PEI的气雾化的纳克量级pDNA350ng)，比通过气管内插管直接应用至小鼠肺的140倍高剂量(50μg)的同一载体，产生15倍高的转染水平。此外，Bettinger等人(NucleicAcidsRes.2001,29:3882-91)证明脂质复合物，而非基于聚乙烯亚胺(分枝PEI25和线性PEI22kDa)、聚(L-赖氨酸)(PLL，54kDa)的聚合复合物(polyplexes)或树枝状聚合物，在转染的B16-F10细胞中介导有效的mRNA翻译。在无细胞翻译实验以及随后的细胞质注射入Rat1细胞中采用PEI25kDa/mRNA或者PLL54kDa/mRNA的表达缺乏，表明这些聚合复合物过于稳定以至于不能释放mRNA。这表明mRNA和转染试剂之间静电相互作用的强度对所达到的表达水平有显著影响，热力学稳定的聚合复合物载体(如PEI-mRNA)不太适合mRNA翻译。通过使用更短的聚阳离子降低载体和mRNA之间的静电相互作用赋予表达的大幅度提高，相较于DOTAP/mRNA，使用低分子量PEI和PLL形成的mRNA聚合复合物实现了5倍高的萤光素酶表达水平。然而，使用低分子量聚阳离子形成的聚合复合物失去了其内体裂解(endosomolytic)活性，并且需要氯喹介导mRNA的表达。通过将低分子量PEI缀合至膜活性肽蜂毒肽以恢复内体裂解(endosomolysis)，并在没有氯喹时证实了高水平的mRNA表达。总之，这些观察表明单链mRNA结合至阳离子聚合物比pDNA的结合更强很多。这进一步得到Huth等人的证实(J.GeneMed.2006,8:1416–1424)，其提出作为核进入、转录和成功转基因表达的前提，细胞质RNA参与pDNA从阳离子聚合物的释放。总之，这些观察表明PEI25kDa无法调解功能mRNA到细胞中的递送。因为涉及插管的连续重复治疗与生活质量的要求不相适应，基于本专利技术的任务是提供一种用于信使RNA肺递送的适合的和非侵入性方法，以产生所述mRNA编码的蛋白的肺表达。现有技术缺少用于mRNA肺递送的非侵入性方法。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是提供一种用于通过非侵入性的肺应用来递送mRNA治疗剂的方法，其导致在肺内产生有效水平的编码的蛋白。因此，本专利技术提供了一种用于在肺中表达mRNA的方法，其中-将待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)组合来提供包含mRNA和PEI的组合；-将包含mRNA和PEI的组合施用至肺，在肺中所述组合进入肺细胞；以及-mRNA在肺细胞中表达。本专利技术特别适用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在肺中表达mRNA的方法，其中‑将待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)组合来提供包含mRNA和PEI的组合物；‑将包含mRNA和PEI的组合物施用至肺，在肺中所述组合物进入肺细胞；以及‑在肺细胞中表达mRNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.08 US 61/657,3441.待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)组合在不存在靶向配体时在制备通过在肺中表达mRNA、用于治疗肺缺陷的药物中的用途，其中所述药物包含施用至肺的mRNA和PEI，在肺中其进入肺细胞；和所述mRNA在肺细胞中表达。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述肺缺陷选自：表面活性剂蛋白B(SPB)缺乏症、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)缺乏症、囊性纤维化、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、肺癌、表面活性剂蛋白C(SPC)缺乏症、肺泡蛋白沉积症、结节病、急性和慢性支气管炎、肺气肿、McLeod-综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张、肺尘埃沉着病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)、肺水肿、肺嗜酸粒细胞增多、洛夫勒肺炎、Hamman-Rich综合征、特发性肺纤维化、间质性肺病、原发性纤毛运动障碍、肺动脉高压(PAH)和STAT5b缺乏症、凝血缺陷、补体缺陷、血栓性血小板减少性紫癜和先天性血色素沉着症、肺感染性疾病、副流感病毒(PIV)感染、流感病毒感染、鼻病毒感染和严重急性呼吸综合征、结核病、绿脓杆菌感染、洋葱伯克霍尔德氏菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、以及流感嗜血杆菌感染。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述肺缺陷选自：石棉沉着病、血友病A和B、蛋白C缺乏症、铁调素缺乏症、呼吸道合胞病毒(RSV)感染和冠状病毒(SARS-CoV)感染。4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述PEI具有1kDa至1000kDa的分子量。5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述PEI具有10kDa至50kDa的分子量。6.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述PEI具有20至30kDa的分子量。7.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述的待表达的mRNA与聚乙烯亚胺(PEI)的组合由以下组成：i)所述的mRNA和PEI；ii)所述的mRNA和PEI和药学上可接受的水；或iii)i)或ii)和药学上可接受的载体和/或其它辅助化合物。8.根据权利要求7所述的用途，其中药学上可接受的水选自蒸馏水、高压灭菌的超纯水和自来水。9.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述mRNA编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)、表面活性剂蛋白B(SPB)、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)或α-1抗胰蛋白酶(A1AT)、表面活性剂蛋白C(SPC)、促红细胞生成素、因子VIII、因子IX、vanWillebrand因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、ADAMTS13、铁调素、血管紧张素转换酶II或者病毒和细菌病原体的抗原。10.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述包含mRNA和PEI的药物作为气雾气管内施用至肺。11.根据权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述包含mRNA和PEI的药物通过高压喷射施用至肺。12.包含mRNA和PEI的药物组合物在不存在靶向配体时在制备通过在肺中表达mRNA、用于治疗肺缺陷的药物中的用途。13.根据权利要求12所述的用途，其中所述肺缺陷选自：表面活性剂蛋白B(SPB)缺乏症、ATP结合盒亚家族A成员3(ABCA3)缺乏症、囊性纤维化、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、肺癌、表面活性剂蛋白C(SPC)缺乏症、肺泡蛋白沉积症、结节病、急性和慢性支气管炎、肺气肿、McLeod-综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管哮喘、支气管扩张、肺尘埃沉着病、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合征(IRDS)、肺水肿、肺嗜酸粒细胞增多、洛夫勒肺炎、Hamman-Rich综合征、特发性肺纤维化、间质性肺病、原发性纤毛运动障碍、肺动脉高压(PAH)和STAT5b缺乏症、凝血缺陷、补体缺陷、血栓性血小板减少性紫癜和先天性血色素沉着症、肺感染性疾病、副流感病毒(PIV)感染、流感病毒感染、鼻病毒感染和严重急性呼吸综合征、结核病、绿脓杆菌感染、洋葱伯克霍尔德氏菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染、以及流感嗜血杆菌感染。14.根据权利要求12所述的用途，其中所述肺缺陷选自：石棉沉着病、血友病A和B、蛋白C缺乏症、铁调素缺乏症、呼吸道合胞病毒(RSV)感染和冠状病毒(SARS-CoV)感染。15.根据权利要求12至14中任一项所述的用途，其中所述PEI具有1kDa至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·盖格，M·K·阿内加，C·鲁道夫，
申请(专利权)人：埃泽瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE