本发明专利技术提供了从鉴定为具有杀虫多肽的细菌菌株中分离和鉴定编码杀虫剂的新型核酸分子的方法。所述方法涉及挑选具有或疑似具有至少一个编码杀虫剂的质粒的细菌菌株、消除来自所述细菌菌株的所述至少一个编码杀虫剂的质粒，以及进行消减杂交以获得编码所述杀虫多肽的质粒mRNA。可使用所述质粒mRNA来制备cDNA文库，从所述cDNA文库可以分离并随后鉴定出所述杀虫多肽。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于发现编码杀虫剂的新型核酸分子的细菌信使核糖核酸筛选策略
本专利技术整体涉及用于分离和识别编码杀虫剂的新型核酸分子的方法，更具体地讲，涉及通过消减杂交从原核生物(例如细菌)中分离和识别编码杀虫剂的核酸分子的方法。
技术介绍
害虫(例如昆虫害虫)是造成全世界农作物损失的主要因素。例如，玉米根虫摄食损害和棉籽象鼻虫损害可以在经济上给农作物生产者带来毁灭性的打击。每年玉米根虫单独造成的与昆虫害虫相关的农作物损失已达到十亿美元。传统上，控制昆虫害虫(例如玉米根虫)的主要方法是作物轮作和施用广谱、合成的化学杀虫剂。然而，消费者和政府监管者都越来越重视与化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。由于这些关注，监管者已禁止或者限制了一些危害比较大的化学杀虫剂的使用。因此，人们有极大的兴趣开发具有更低的污染风险和环境危害以及与化学杀虫剂的特征相比提供更高的靶标特异性的化学杀虫剂的替代方案。芽孢杆菌属{Bacillus)中的某些种具有对多种昆虫害虫具有杀虫活性的多肽，这些昆虫害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目以及其他中的那些。例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和日本金龟芽抱杆菌{Bacillus popilliae)是至今为止发现的最成功的具有杀虫活性的物种。幼虫芽孢杆菌(AaciTrAz1S、缓病芽孢杆菌(Bacillus 、球形芽抱杆 菌{Bacillus sphaericus)和腊状芽抱杆菌{Bacillus cereus)的菌株也被指出具有这类杀虫活性。参见Handbook 2:Bacillus (Harwood ed., Plenum Press 1989)(《生物技术手册 2:芽抱杆菌》,Harwood 编辑，Plenum出版社，1989年)；和国际专利申请公开N0.WO 96/10083。来自芽孢杆菌属的杀虫多肽包括结晶(Cry)内毒素、细胞溶解(Cyt)内毒素、植物性蛋白(VIP)等。参见如 Bravo et al.(2007) Toxicon 49:423-435 (Bravo 等人，2007年，《毒素》，第49卷,第423-435页)。Cry内毒素(也称为S -内毒素)是从苏云金芽孢杆菌的菌株中分离出来的杀虫多肽。Cry内毒素最初以无活性原毒素形式产生，该形式通过昆虫肠道中蛋白酶的作用而蛋白水解转化为活性内毒素。一旦具有活性，内毒素就结合至肠道上皮细胞并形成阳离子选择性通道，造成细胞溶解并随后死亡。参见Cairoll et al.(1997) J.1nvertebr.Pathol.70:41-49 (Carroll 等人，1997 年,《无脊椎动物病理学杂志》，第 70卷，第 41-49页);0ppert (1999) Arch.1nsect Biochem.Phys, 42: l-12(0ppert,1999年，《昆虫生物化学与生理学文献》，第42卷，第1-12页);以及Rukmini et al.(2000)Biochimie 82:109_116(Rukmini 等人，2000 年，《生物化学》，第 82 卷，第 109-116 页)。Cry内毒素的共同特点是它们在生长的稳定期内表达，因为它们通常在母细胞区室中积累以形成可以占形成孢子的细胞干重23-30%的结晶内含物。最近，科学家通过用编码杀虫剂的核酸分子(例如Cry内毒素)对作物进行遗传工程改造，开发出了抗虫性增强的作物。例如，已对玉米和棉花植物进行遗传工程改造以产生 Cry 内毒素。参见如 Aronson (2002) Cell Mol.Life Sc1.59:417-425 (Aronson,2002年，《细胞学和分子生命科学》，第59卷，第417-425页);以及SchMpf et al.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775-806 (Schn印f 等人，1998 年，《微生物学与分子生物学评论》，第62卷，第775-806页)。已对其他作物(包括土豆)进行遗传工程改造以包含Cry内毒素。参见如 Hussein et al.(2006) J.Chem.Ecol.32:1-8 (Hussein 等人,2006年，《化学生态学杂志》，第32卷,第1-8页)；以及Kalushkov & Nedved (2005) J.Appl.Entomol.129:401-406 (Kalushkov 和 Nedved, 2005 年，《应用昆虫学杂志》，第 129 卷，第401-406页)。这些植物目前在美国农业中广泛应用，给农场主提供了替代化学杀虫剂的环境友好的方案。基于这些成就，研究人员继续寻找编码杀虫剂的新型核酸分子，例如额外的基因。因此，在本领域中需要用于有效识别编码杀虫剂的新型核酸分子的新方法。
技术实现思路
本专利技术提供了用于分离和识别编码杀虫剂的新型核酸分子的方法。该方法使编码杀虫剂的核酸分子，特别是质粒mRNA，在被鉴定为具有杀虫多肽的细菌菌株中富集。该方法涉及挑选具有或疑似具有至少一种杀虫蛋白的细菌菌株、消除来自所述细菌菌株的质粒以及进行体外或计算机模拟的消减杂交以获得质粒mRNA。在一个实施例中，消减杂交可以在体外或通过计算机模拟进行。对于体外方法，可使用质粒mRNA来制备cDNA文库,从该cDNA文库可以分离并随后鉴定出杀虫多肽。对于计算机模拟方法，可以鉴定出杀虫编码序列。本专利技术提供了包含分离的编码杀虫剂的核酸分子及其变体和片段、以及杀虫多肽及其变体和片段的组合物。还提供了包含编码杀虫剂的核酸分子的生物体。因此，本专利技术的方 法和组合物可用于发现编码杀虫多肽的核酸分子和保护植物免受害虫(特别是昆虫害虫)损害的杀虫多肽。【附图说明】图1示出了在接种后的8至32小时之间每4小时收集的样品中苏云金芽孢杆菌菌株DP1019的RNA时序表达。【具体实施方式】概论 本专利技术提供了分离和鉴定编码杀虫多肽的新型核酸分子的方法。该方法涉及鉴定包含或疑似包含杀虫蛋白的细菌。编码内毒素的基因主要位于大质粒上，但染色体编码的内毒素也有报道。参见 Ben-Dov et al.(1996) Appl.Environ.Microbiol.62:3140-3145(Ben-Dov等人，1996年，《应用与环境微生物学》，第62卷，第3140-3145页)；Berry etal.(2002) Appl.Environ.Microbiol.68:5082-5095 (Berry 等人，2002 年，《应用与环境微生物学》，第 68 卷，第 5082-5095 页);Gonzdles et al.(1981) Plasmid 5:351-365(Gonzdles 等人，1981 年，《质粒》,第 5 卷,第 351-365 页)；Lereclus et al.(1982) Mol.Gen.Genet.186:391-398 (Lereclus等人，1982年，《分子遗传学与普通遗传学》，第186 卷，第 391-398 页)；以及 Trisrisook et al.(1990) Appl.Environ.Microbiol.56:1710-1716 (Trisrisook等人，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.02 US 61/481,4421.一种用于鉴定至少一种编码具有杀虫活性的多肽的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤: (a)提供具有或疑似具有编码杀虫剂的核苷酸序列的细菌菌株； (b)消除来自所述细菌菌株的质粒，从而形成对照菌株； (c)对所述对照菌株和所述具有所述编码杀虫剂的核苷酸序列的细菌菌株(靶菌株)的所述多核苷酸序列进行消减杂交，以鉴定疑似编码所述具有杀虫活性的多肽的序列；以及 (d)鉴定至少一种具有杀虫活性的多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述消减杂交为体外消减杂交。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述消减杂交为计算机模拟消减杂交。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括: (a)纯化来自所述对照菌株的mRNA分子； (b)纯化来自所述靶菌株的mRNA分子； (c)使用所述对照菌株的所述mRNA分子和所述靶菌株的所述mRNA分子进行消减杂交，以分离所述靶菌株的所述细菌菌株的独特mRNA分子； (d)由所述独特的mRNA分子生成cDNA表达文库； (e)筛选所述cDNA表达文库，以获得至少一种编码具有杀虫活性的多肽的cDNA。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括: (a)对所述对照菌株的所述基因组进行测序； (b)对所述靶菌株的所述基因组进行测序； (c)鉴定独特的序列；以及 (d)分析独特的序列，以获得那些编码杀虫多肽的序列。6.一种用于鉴定至少一种编码具有杀虫活性的多肽的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤: (a)提供具有或疑似具有编码杀虫剂的核苷酸序列的细菌菌株； (b)消除来自所述细菌菌株的所述质粒； (c)纯化来自(a)的所述细菌菌株的mRNA分子； (d)纯化来自(b)的所述细...
【专利技术属性】
技术研发人员：AR阿巴德，DM卡普卡基茨曼，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：
国别省市：
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