信使RNA帽的抗‑反向硫代磷酸类似物的合成和用途制造技术

公开了新的RNA帽类似物，其包含一个或多个硫代磷酸基团。所述类似物还在7‑甲基鸟苷的2’‑O位置处包含修饰，其防止它们在mRNA的体外合成过程中以相反的方向掺入，并因此是“抗‑反向帽类似物”(anti‑reverse cap analog，ARCA)。所述ARCA修饰确保，S原子在翻译和脱帽机器中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。所述新的S‑ARCA类似物对于体内脱帽酶具有抗性。有些S‑ARCA具有相比于不包含硫代磷酸基团的相应类似物而言更高的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S‑ARCA的mRNA引入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m

【技术实现步骤摘要】
信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途本申请是申请日为2008年6月19日、申请号为200880102959.9、专利技术名称为“信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途”的专利技术专利申请的分案申请。Jacek Jemielity, Ewa M.Grudzien-Nogalska, Joanna Kowalska, EdwardDarzynkiewicz,和 Robert E.Rhoads文件编号:Jemielity07S01W在美国中根据35U.S.C.§ 119(e)，和在所有国家中根据适用的条约和公约，要求2007年6月19日提交的临时美国申请系列号60/944,842的提交日期的权益。本专利技术的开发部分地在由国家综合医学研究所(Nat1nal Institute of GeneralMedical Sciences)给予的基金号R01GM20818下得到美国政府的资助。美国政府享有本专利技术中的某些权利。本专利技术的开发部分地在由波兰科学和高等教育部(Polish Ministry of Scienceand Higher Educat1n)给予的基金号2P04A00628下得到波兰政府的资助。
合成了新的信使RNA帽的抗-反向(ant1-reverse)硫代磷酸类似物,并且显示在mRNA的翻译中是有用的。 技术背景 在真核细胞中，大多数信使RNA(mRNA)的5’末端被封闭，或“帽化(加帽)”。此外，还存在有一些也被帽化的其他形式的RNA，例如核内小RNA(snRNA)。所述帽包含有在两个核苷部分之间的5’ -5’三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基。mRNA和snRNA的帽化促进其在细胞中的正常功能。 能够在体外合成加帽的RNA分子是有用的，因为这使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。 最经常用来在体外制备加帽的RNA的方法是，在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸例如m7G(5’)ppp(5’)G(此后，m7GpppG)存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶来转录DNA模板。聚合酶以下列方式来起始转录:m7GpppG的Guo部分的3’ -OH对于下一个由模板所决定的核苷三磷酸上的ct -磷酸发动亲核攻击，从而导致产生初始产物m7GpppGpN。通过在转录反应混合物中将m7GpppG与GTP的比率设定为在5和10之间来遏制备选的、由GTP起始的产物pppGpN。 [0011 ] 合成RNA可以通过DNA模板的无细胞转录来合成。参见R.Contreras等人,“Simple, efficient in vitro synthesis of capped RNA useful for directexpress1n of cloned eukaryotic genes,，，Nucl.Acids Res.,第 10 卷，第 6353-6362页(1982) ;J.Yisraeli 等人，“Synthesis of long, capped transcripts in vitro bySP6and T7RNA polymerases,第 42-50 页，在 J.Dahlberg 等人(编辑)，Meth.Enzymo1.，第 180 卷，第 42-50 页(1989)中；和 D.Melton 等人，“Efficient in vitro synthesis ofb1logically active RNA and RNA hybridizat1n probes from plasmids containinga bacter1phage SP6promoter，，，Nucl.Acids Res.，第 12 卷，第 7035-7056 页(1984)。 如此产生的加帽的RNA在体外进行的剪接反应中是有活性的。参见M.Konarska等人，“Recognit1n of cap structure in splicing in vitro of mRNA precursors.Cell,第 38 卷，第 731-736 页(1984);和 1.Edery 等人，“Cap-dependent RNA splicing in aHeLa nuclear extract，，，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，第 82 卷，第 7590-7594 页(1985)。 加帽的mRNA在无细胞翻译体系中比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见 S.Muthukrishnan 等人，“5’-Terminal7_methylguanosine in eukaryoticmRNA is required for translat1n，，，Nature，第 255 卷，第 33-37 页(1975)；L.Chu 等人，“Paradoxical observat1ns on the5’ terminus of ovalbuminmessenger ribonucleic acid，，，J.B1l.Chem.，第 253 卷，第 5228-5231 页(1978)； E.Darzynkiewicz 等人，“ β-Globin mRNAs capped with m7G, m22' 7G or m32'2'7G differin intrinsic translat1n efficiency，，，Nucl.Acids Res.,第 16 卷，第 8953-8962页(1988)；和 Ε.Darzynkiewicz 等人，“Inhibit1n of eukaryotic translat1n bynucleoside5’-monophosphate analogues of mRNA5’-cap:Changes in N7substituentaffect analogue activity，” B1chem.，第 28 卷，第 4771-4778 页(1989)。 5’-未甲基化的mRNA在翻译上的活性比5’-甲基化的mRNA低。参见G.Both等人，“Methylat1n-dependent translat1n of viral messenger RNAs in VitrojnProc.Natl.Aca d.Sc1.USA,第 72 卷，第 1189-1193 页(1975)。 通过电穿孔引入培养的哺乳动物细胞中的加帽的mRNA比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见 E.Grudzien 等人，“Differential inhibit1n of mRNA degradat1npathways by novel cap analogs, ” J.B1l.Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 页(2006) ? A.Pasquinelli 等人，“Reverse5，caps in RNAs made in 本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，其包含其中：每个Y选自O和S；各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S；R1选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；R2选自H、OH、OCH3和OCH2CH3；n是3或4；和如果R1是OH，那么R2不是OH。

【技术特征摘要】
2007.06.19 US 60/944,8421.组合物，其包含其中: 每个Y选自O和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;Rl 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ；R2 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ； η是3或4 ;和 如果Rl是0Η，那么R2不是0Η。2.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。3.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。4.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求1的组合物。5.用于在体外合成权利要求4中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。6.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求2中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。7.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求4中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。8.权利要求1中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y -硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。9.权利要求1中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ -硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。10.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求8中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。11.组合物，其包含其中: 每个Y选自0和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;Rl 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ；R2 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ； η是3或4 ;和 如果Rl是0Η，那么R2不是OH ； 和B选自12.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。13.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。14.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求11的组合物。15.用于在体外合成权利要求14中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ΑΤΡ、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。16.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求14中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。17.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求14中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。18.权利要求11中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。19.权利要求11中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。20.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求17中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。21.组合物，其包含其中: 每个Y选自0和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;Rl 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ；R2 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ； η是3或4 ;和 如果Rl是0Η,那么R2不是OH ;和 B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和 X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团。22.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。23.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。24.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求21的组合物。25.用于在体外合成权利要求24中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。26.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求24中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。27.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求24中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。28.权利要求21中所描述的 组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。29.权利要求21中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。30.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求28中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。31.组合物，其包含其中: 每个Y选自O和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ; η是3或4 ; B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和 X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及经取代或未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团。32.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。33.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。34.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求31的组合物。35.用于在体外合成权利要求34中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ATP、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·杰米利迪，E·M·戈鲁德琪恩诺加尔斯卡，J·克瓦尔斯卡，E·达琴奇维克孜，R·E·罗德斯，
申请(专利权)人：路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会，华沙大学，
类型：发明
国别省市：美国;US