蛋白产品的总核苷酸测定方法技术

蛋白产品的总核苷酸测定方法，采用如下步骤：(1)配制碱基混合标准液；(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过出峰面积比较得到样品中游离碱基的含量值，并得到游离碱基的总含量；(3)待测样品进行完全水解处理，用高效液相色谱法定量测定完全水解后的总碱基含量；(4)以步骤3所得的总碱基含量减去步骤2所得的游离碱基含量后经分子量换算得到核苷酸的含量。本发明专利技术所使用的方法测量准确，能准确反应单细胞蛋白产品中核苷酸的含量，从而衡量该产品的营养价值和质量优劣。除了单细胞蛋白以外，本发明专利技术的方法还适用于奶制品、饲料、藻类等富含核苷酸的原料。

【技术实现步骤摘要】
蛋白产品的总核苷酸测定方法
本专利技术涉及核苷酸测定

技术介绍
单细胞蛋白(Singlecellprotein简称SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利用工业废水、废气、天然气、石油烷烃类、农副加工产品以及有机垃圾等作为培养基，培养酵母、非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品工业和饲料工业重要的蛋白质来源。单细胞蛋白与其它蛋白相比的一大优点就是其较少的细胞培养时间，微生物有机体蛋白产品的产率比其它传统蛋白产率要高。单细胞蛋白(SCP)与传统蛋白相比具有不受环境和气候的影响、原料易得、可连续生产、易于控制、污染小等优势。单细胞蛋白产品含有丰富的蛋白质，氨基酸的种类齐全，比例适当。单细胞蛋白还含有丰富的脂肪、碳水化合物、核酸、维生素和无机盐，并含有钙、磷、钾、铁、镁、钠、锰等矿物质元素，还含有多种酶。核苷酸是细胞组成主要成分，是组成DNA和RNA单体，在细胞结构、代谢、能量和调节功能等方面起重要作用，其生理生化功能有：作为RNA和DNA合成的原料；作为代谢的调节物质；作为辅酶的成分，如辅酶A；激活糖原和糖蛋白合成的重要中介物，也是磷脂合成的中介物，活化中间产物；参与遗传信息传递；ATP是生命过程的直接能；AMP调节平滑肌的收缩性并可调节血流量；核苷酸还可以作为甲基的供体等。因此外源核苷酸具有重要生物学作用。饲料工业中单细胞蛋白是外源核苷酸的廉价且非常可靠的来源。因此，确定原料中准确的核苷酸的含量就是一件非常重要的工作。目前核酸类的测定方法可以分为两大类：核酸的定量分析及核酸水解物的测定。核酸的定量方法主要有：定磷法、紫外法、苔黑酚法。核酸水解物的测定包含测定核苷酸、核苷及各种碱基，这些水解物比较成熟的方法是使用高效液相色谱仪进行的，有些也已经有成熟的应用，例如，婴幼儿乳粉中游离核苷酸的测定。然而，上述方法都各有特点及缺点，有其特定的适用范围，在应用于测定单细胞蛋白核苷酸的测定时会产生很多问题，从而导致测定结果出现错误。定磷法测定原理是核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5％～9.0％)，测定其含磷量即可换算出核酸的量。但是方法无法区分核酸磷和其他有机磷，这会导致蛋白原料中的核酸磷及其他有机磷全部计算为核酸的含磷，从而导致测定结果显著偏高。吸光度法测定核酸的原理是利用核酸中碱基含有的共轭双键的260nm紫外吸光度的特点进行测定。该方法的缺点是：1)实质上定量的是共轭双键的含量；2)含有共轭双键的物质包括：核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、碱基、1,3‐丁二烯、环己烯等核酸及非核酸类物质；4)共轭双键的含量大小依次是：碱基>核苷>核苷酸；6)分子生物学上指出了紫外法测定只适用于纯的核酸样品，不适用于含有多种核酸水解物的样品。因此也不适用于酵母、酶解酵母等单细胞蛋白原料，因为它们除了有核酸也含有很多核酸的水解物。苔黑酚法测定核酸的原理是：核酸在酸水解后，降解形成的核糖转变为糠醛，后者与地衣酚(3,5-二羟甲苯)作用生成绿色化合物，在670nm处有最大吸收。其缺点是：地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，核酸水解物及糖类物质对其测定结果影响较大。因此对于化学组分复杂多样的单细胞蛋白类的产品测定结果会误差很大。核酸水解物包括核苷酸、核苷、碱基。核苷酸包括鸟苷酸、腺苷酸、尿苷酸、胞苷酸、肌苷酸。核苷包括鸟苷、腺苷、尿苷、肌苷、胞苷。核糖核酸的碱基有四种腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，脱氧核糖核酸还具有胸腺嘧啶。这些水解物已有文献报道可使用高效液相色谱测定其含量。公告授权号为CN102680601B的专利技术专利<乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法>公开了一种乳粉中测定核苷酸的方法，公开了使用液相色谱的液相条件、标准品、样品前处理方法等，很好的解决了乳粉核苷酸的测定。但是和其他液相测定核苷酸的方法类似，在应用于单细胞蛋白的核苷酸测定时显示了不适用的情况。不适用的原因为：1)方法多为游离态的核苷酸；2)只测定了核苷酸没有测定核苷，对动物营养角度来说，核酸水解物除了碱基以外都能发挥营养及免疫的功能；3)细胞核内的未游离态核苷酸不能测定；4)在实际的单细胞蛋白原料中核苷酸的形态多样，有核苷形式、核苷酸形式、二磷酸核苷酸、三磷酸核苷酸、寡核苷酸，这些都没有在测定方法中有所体现。
技术实现思路
营养学意义上的核苷酸不仅仅包括单体的核苷酸，也包括其他形式的如寡核苷酸、核苷酸、核苷。碱基则无法提供营养及免疫功能。有研究显示动物摄入外源碱基(嘌呤及嘧啶)会有以下问题：1)食物来源的嘌呤和嘧啶极少被机体利用；2)直接摄入嘌呤及嘧啶会加重肝肾代谢的负担；3)嘌呤的直接摄入会导致尿酸偏高；4)腺嘌呤本身有毒，会致雄性不育和慢性肾衰，也会影响动物生长。因此，获得除碱基以外的所有核苷酸类物质在营养学上具有重要的意义。相应地，检测食物中的核苷酸类物质的含量就具有重要的医学、食品营养及商业价值。这也是本专利技术要解决的技术问题。本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可测定单细胞蛋白产品中所含总核苷酸含量的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：蛋白产品的总核苷酸测定方法，其特征在于采用如下步骤：(1)配制碱基混合标准液；(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过出峰面积比较得到样品中游离碱基的含量值，并得到游离碱基的总含量；(3)待测样品进行完全水解处理，用高效液相色谱法定量测定完全水解后的总碱基含量；(4)以步骤3所得的总碱基含量减去步骤2所得的游离碱基含量后经分子量换算得到核苷酸的含量。所述步骤3中待测样品进行完全水解处理是通过以下操作实现的：称取待测样品，置于耐压消化管中；在耐压消化管中加入高氯酸消化液，使待测样品水解；放入烘箱内100～110℃消化50～70min；使用10～20％氢氧化钾溶液调pH至6.5～7.5，备用。所述高氯酸消化液中高氯酸的质量百分比浓度为70％。所述步骤2中测定游离碱基含量及步骤3中测定总碱基含量的色谱条件为：流动相A采用0.1mol/L磷酸二氢钾溶液，pH＝4.9～5.1；流动相B采用25％甲醇溶液。测定总碱基含量采用如下梯度洗脱程序：测定游离碱基含量采用如下梯度洗脱程序：核糖核酸在不完全水解情况下产生寡核苷酸、核苷酸、核苷、碱基、磷酸和糖，在完全水解的情况下分解为嘌呤碱基、嘧啶碱基、磷酸和糖。使用HPLC定量测定完全水解后碱基(胞嘧啶Cytosine、尿嘧啶Uracil、鸟嘌呤Guanine、腺嘌呤Adenine)的含量即为总碱基含量，再测定样品中游离态的碱基，总碱基减去游离碱基即为来源于核苷酸的碱基，然后根据分子量换算得到核苷酸的含量。本专利技术所使用的方法测量准确，能准确反应单细胞蛋白产品中核苷酸的含量，从而衡量该产品的营养价值和质量优劣。除了单细胞蛋白以外，本专利技术的方法还适用于奶制品、饲料、藻类等富含核苷酸的原料。附图说明图1为采用HPLC法检测标准品总碱基的洗脱结果图。图2为采用HPLC法检测标准品游离碱基的洗脱结果图。图3为采用HPLC法检测样品中游离碱基含量的洗脱结果图。图4为采用HPLC法检测样品中总碱基的含量的洗脱结果图。具体实施方式以下为本专利技术的实施步骤：本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白产品的总核苷酸测定方法，其特征在于采用如下步骤：(1)配制碱基混合标准液；(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过出峰面积比较得到样品中游离碱基的含量值，并得到游离碱基的总含量；(3)待测样品进行完全水解处理，用高效液相色谱法定量测定完全水解后的总碱基含量；(4)以步骤3所得的总碱基含量减去步骤2所得的游离碱基含量后经分子量换算得到核苷酸的含量。

【技术特征摘要】
1.蛋白产品的总核苷酸测定方法，其特征在于采用如下步骤：(1)配制碱基混合标准液:配制胞嘧啶标准储备液：称取胞嘧啶1.0044克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解；配制尿嘧啶标准储备液：称取尿嘧啶0.9976克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解；配制鸟嘌呤标准储备液：称取鸟嘌呤0.1000克，加0.1M氢氧化钠溶液150～180ml，全部溶解后加水定容至250ml；配制胸腺嘧啶标准储备液：称取胸腺嘧啶1.0133克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解；配制腺嘌呤标准储备液：称取腺嘌呤1.0171克，加水定容至250ml，70℃热水浴加热溶解；依次量取胞嘧啶标准储备液1.0ml、尿嘧啶标准储备液1.0ml、鸟嘌呤标准储备液10.0ml、胸腺嘧啶标准储备液1.0ml、腺嘌呤标准储备液1.0ml至250ml容量瓶内，加水定容至250ml，混合标准液胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤的浓度分别为16.07、15.99、19.55、16.21、16.27ug/ml，分装至0.5ml冻存管内，-20℃保存，从而配得碱基混合标准液；(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过出峰面积比较得到样品中游离碱基的含量值，并得到游离碱基的总含量,(3)待测样品进行完全水解处理，用高效液相色谱法定量测定完全水解后的总碱基含量，完全水解处理通过以下操作实...

【专利技术属性】
技术研发人员：许建刚，高会玲，
申请(专利权)人：上海征泰饲料有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31