一种RNA片段及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种制备RNA片段的方法，该方法包括：（1）获得化学合成的双链DNA；（2）将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒，并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增质粒的克隆作为模板质粒；（3）对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段；（4）对所述转录模板片段进行体外转录，得到转录产物。本发明专利技术还提供了如上所述的方法制备得到的RNA片段及其用途。本发明专利技术大幅度地提高了制备的RNA片段在序列和长度上的完全正确性和均一度。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA片段及其制备方法和用途
本专利技术涉及医药生物领域，具体地，涉及分子生物
，更具体地，涉及一种制备RNA片段的方法、该方法制备得到的RNA片段以及该RNA片段的用途。
技术介绍
最近十几年小的非编码RNA(smallnon-codingRNAs)，尤其是微RNA(microRNA，即miRNA)的研究非常火热，技术人员非常看好以微RNA作为靶点来研发诊断试剂盒和研发小核酸药物的前景(JacksonandLevin,2012；vanRooijetal.,2012)。由于微RNA通常只有18-25个碱基(Bartel,2004)，而且一个家族的不同微RNA成员可能只有1-2个碱基的差异(www.mirbase.com)，因此用杂交方法来检测微RNA时，对探针的纯度要求高。如果探针有碱基突变的话，会导致检测结果为假阴性或假阳性(Baradetal.,2004)。现有的生产微RNA探针的方法有两种：一种是通过化学合成与微RNA互补的RNA链，然后通过末端转移酶把一个带DIG或其它标记物的核苷酸加在RNA链的末端，从而使探针被标记好，以便于后续的检测，这类探针在早期发表的微RNA文献中大量使用(Chen,2004)。第二种方法是在化学合成与微RNA互补的DNA探针时，把RNA核苷酸类似物锁核酸(lockednucleicAcid，LNA)参入探针中，得到锁核酸修饰的DNA探针(LNA-modifiedDNAprobes，如Exiqon公司生产的产品)，然后再通过末端标记使探针的一端或两端都带上DIG或其它的标记物。现在，这种LNA修饰的DNA探针被大量应用于检测微RNA的研究中。上述两种方法的缺点有三：第一，RNA或DNA的化学合成都是从核酸的3’向5’端逐渐加上单个的碱基，因为每次合成一个碱基时效率都达不到100％(Reese,2005)，所以无论是化学合成的RNA还是DNA，都有一定的错误率，且错误率随合成的核苷酸长度的增加而增加。虽然合成后的纯化(常用HPLC或PAGE纯化)能帮助富集预期目的大小的核苷酸，但无法减少拥有同样大小的序列突变的杂质核苷酸。第二，其标记探针的方法都是在探针的一端或两端加上带标记的一个碱基，这使得探针的序列比要检测的微RNA序列多1或2个碱基，这会影响探针的特异性。第三，因为探针最多只携带两个标记物，所以检测的灵敏度有限，无法检测那些低丰度表达的微RNA。已经公开了用T7RNA聚合酶(T7RNApolymerase)以体外转录的方式制备短RNA的方法(Milliganetal.,1987)，具体地，该方法使用了如下3种模板：(1)化学合成的完全双链DNA，其编码链由T7启动子和RNA片段的DNA模板连接而成；(2)酶切线性化的质粒双链DNA，其编码链由线性载体片段、T7启动子和目的RNA片段的编码DNA连接而成；(3)化学合成的由双链区和单链区连接而成的DNA，双链区为完全双链的T7启动子，单链区为RNA探针的DNA模板。用该方法制备短RNA探针，会存在下列问题：(1)化学合成的模板会引入和扩增DNA合成时的突变，从而降低了探针的纯度和特异性；(2)以酶切线性化的质粒双链DNA为模板的方法，虽然保证了模板的完全正确性，但由于该方法使用的是一型限制性内切酶，所以线性化的模板在编码RNA的序列后面衔接着酶切位点的残余序列，使得转录出来的RNA比目的RNA片段多几个碱基，也降低了探针的特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有的RNA探针的特异性较低和灵敏度较差的缺陷，提供一种特异性较高且灵敏度较好的RNA片段及其制备方法。为了实现上述目的，一方面，本专利技术提供了一种制备RNA片段的方法，该方法包括：(1)获得化学合成的双链DNA，所述化学合成的双链DNA由编码链和模板链配对而成；在从所述编码链的5’至3’方向上，第一内切酶的酶切位点、启动子、目的RNA片段的编码DNA和第二内切酶的酶切位点依次连接；(2)将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒，并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增质粒的克隆作为模板质粒；(3)使用第一内切酶和第二内切酶对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段；其中，第二内切酶能够在目的RNA片段的DNA模板链的5’末端切开，以使转录模板片段的模板链的5’末端能够与目的RNA片段的3’末端形成平末端的双链；(4)对所述转录模板片段进行体外转录，得到含有目的RNA片段的转录产物。另一方面，本专利技术还提供了一种RNA片段，该RNA片段是根据如上所述的方法制备得到的。再一方面，本专利技术还提供了RNA片段在制备核酸药物、检测试剂盒或诊断试剂盒中的用途。通过上述技术方案，本专利技术大幅度地提高了制备RNA片段在序列和长度上的完全正确性和均一度，由此提高了RNA探针的特异性和灵敏度。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1举例性地显示了本专利技术的制备RNA片段的策略。图2显示了转录模板片段T1(泳道1)、转录产物R1(泳道2)、转录产物R1-DB1(泳道4)、转录模板片段T2(泳道6)和转录产物R2(泳道7)的电泳结果，泳道3、5和8分别为分子量标记。图3显示了来源于同一个小鼠胚胎的发育13.5天的冠状切片标本(A，B)和发育11.5天的矢状切片标本(C，D)。同时用本专利技术生产的miR-96RNA探针(B，D)或购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针(miRCURYLNATMDetectionprobe，货号38474-05)(A，C)杂交显色3个小时后，本专利技术生产的miR-96RNA探针检测到的信号(B，D)明显强于购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针(miRCURYLNATMDetectionprobe，货号38474-05)(A，C)。图4显示了来源于同一个小鼠胚胎的发育13.5天的冠状切片标本(A，B)和发育11.5天的矢状切片标本(C，D)。同时用本专利技术生产的miR-96RNA探针(A，C)或购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针(miRCURYLNATMDetectionprobe，货号38474-05)(B，D)杂交后，本专利技术生产的miR-96RNA探针在显色12个小时后检测到的信号非常强(A，C)；相反，购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针(B，D)在显色72个小时检测到的信号还是很弱。这说明本专利技术生产的miR-96RNA探针比购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针(miRCURYLNATMDetectionprobe，货号38474-05)更加灵敏。图5显示了在胚胎发育11.5天的小鼠胚胎矢状切片的背根神经节中，本专利技术生产的miR-96RNA探针在显色12个小时后检测到miR-96特异地高表达(A)；相反，购自Exiqon公司的靶向miRNA-96的探针(miRCURYLNATMDetectionpro本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备RNA片段的方法，该方法包括：（1）获得化学合成的双链DNA，所述化学合成的双链DNA由编码链和模板链配对而成；在从所述编码链的5’至3’方向上，第一内切酶的酶切位点、启动子、目的RNA片段的编码DNA和第二内切酶的酶切位点依次连接；（2）将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒，并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增质粒的克隆作为模板质粒；（3）使用第一内切酶和第二内切酶对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段；其中，第二内切酶能够在目的RNA片段的DNA模板链的5’末端切开，以使转录模板片段的模板链的5’末端能够与目的RNA片段的3’末端形成平末端的双链；（4）对所述转录模板片段进行体外转录，得到含有目的RNA片段的转录产物。

【技术特征摘要】
1.一种制备15-30nt的短RNA片段的方法，该方法包括：(1)获得化学合成的双链DNA，所述化学合成的双链DNA由编码链和模板链配对而成；在从所述编码链的5’至3’方向上，第一内切酶的酶切位点、启动子、目的RNA片段的编码DNA和第二内切酶的酶切位点依次连接；(2)将所述化学合成的双链DNA片段克隆至载体中以得到多个克隆的扩增质粒，并分别对多个克隆的扩增质粒进行DNA测序；挑选能够完全正确编码目的RNA片段的扩增质粒的克隆作为模板质粒；(3)使用第一内切酶和第二内切酶对模板质粒进行酶切，得到酶切产物，并从酶切产物中分离能够完全正确编码目的RNA片段的转录模板片段；其中，第二内切酶能够在目的RNA片段的DNA模板链的5’末端切开，以使转录模板片段的模板链的5’末端能够与目的RNA片段的3’末端形成平末端的双链，其中，第一内切酶为SnaBI或BtsCI；第二内切酶为BtsCI；(4)对所述转录模板片段进行体外转录，得到含有目的RNA片段的转录产物；其中，所述启动子为T7启动子、SP6启动子或T3启动子。2.根据权利要求1所述的方法，其中，目的RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭长庚，温婷，
申请(专利权)人：彭长庚，温婷，
类型：发明
国别省市：湖南;43