本发明专利技术提供了一种基于电化学-DNA反应控制芯片的酸碱法扩增DNA片段技术，具体地，本发明专利技术提供了一种扩增核酸的方法，所述方法包括步骤(a)在pH10-14的碱性条件下使双链核酸分子解链；(b)在pH5-8的中性和近中性条件下使解链的核酸分子与引物进行复性；以及在核酸聚合酶存在下使结合于的单链核酸分子的引物进行延伸从而形成扩增的双链核酸分子。该方法由于其简便、高效、低成本、环境友好等特点，可广泛用于医学检验、刑事证据提取、分子生物学研究等领域。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种基于电化学-DNA反应控制芯片的酸碱法扩增DNA片段技术，具体地，本专利技术提供了一种扩增核酸的方法，所述方法包括步骤(a)在pH10-14的碱性条件下使双链核酸分子解链；(b)在pH5-8的中性和近中性条件下使解链的核酸分子与引物进行复性；以及在核酸聚合酶存在下使结合于的单链核酸分子的引物进行延伸从而形成扩增的双链核酸分子。该方法由于其简便、高效、低成本、环境友好等特点，可广泛用于医学检验、刑事证据提取、分子生物学研究等领域。【专利说明】基于电化学-DNA反应控制芯片的酸碱法扩增DNA片段技术
本专利技术涉及核酸检测领域，具体地，本专利技术涉及一种基于通过溶液pH值控制双链 核酸变性-复性过程的核酸扩增方法。
技术介绍
PCR技术在生命科学实验和生物分子检测等领域广泛使用，对生命科学的发展产 生了难以估量的推动作用。由于其待扩增核酸样品制备简单、样品需要量少、操作简单、扩 增过程完全自动化而逐步运用到相关领域。近些年来，在病理学检验、疾病早期预警、流行 病病毒分离、考古、法医物证学等诸多领域中，PCR技术都有非常精彩的应用。 由于PCR技术具有高度的不可替代性，PCR技术从诞生之时起就处于不断发展、不 断创新之中。当前的PCR技术从温度的变化入手，通过控制DNA分子在不同温度下所进行 的变性、复性和延伸过程，施加 DNA复制所必需的各种碱基、引物、无机离子、缓冲液和DNA 聚合酶，完成DNA分子的高保真度扩增。但是，这一方法具有明显的局限性。其一，每一个 循环PCR反应都涉及温度的大幅度变化，由于温度变化是一个缓慢的过程，所以整个PCR的 反应时间至少需要2小时。其二，每一个循环中，反应温度都在94-36-72摄氏度的区间内 往复变化，电能消耗量高。因此，现行PCR的使用成本也相对较高。电能消耗量高的另一个 副作用是对环境的损害。其三，除了实时定量PCR，常规的PCR反应无法对反应过程进行监 控，无法对DNA扩增的效果进行及时的干预。上述不足之处制约了 PCR技术的进一步发展， 是PCR更广泛使用的瓶颈之一。 综上所述，本领域尚缺乏一种耗能低，反应时间短，可及时干预的PCR技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过调节体系酸碱性控制双链核酸变性-复性过程的 方法。 本专利技术的另一目的是提供一种简便、高效率、能够在常温下进行的PCR技术。 本专利技术的第一方面，提供了一种扩增核酸的方法，所述方法包括： (la)变性步骤：在ρΗΙΟ-14的碱性条件下，使得扩增体系中的双链核酸分子解 链； (lb)复性和延伸步骤：在pH5_8的中性和近中性条件下，使得扩增体系中的单链 核酸分子与引物进行复性，和在核酸聚合酶存在下，使结合于的单链核酸分子的引物进行 延伸，形成扩增的双链核酸分子。 在另一优选例中，所述方法包括重复上述步骤（a)、（b)至少15?60次，较佳地 20?45次。 在另一优选例中，在步骤（a)、和/或（b)中，反应温度为10?70°C;较佳地，反应 温度为15?45°C。 在另一优选例中，在整个扩增过程中，扩增体系的温度维持在10?70°C ;较佳地， 15 ?45°C。 在另一优选例中，步骤（a)中所述pH较佳为11. 5-12. 5。 在另一优选例中，步骤（b)中所述pH较佳为6. 5-7. 5。 各步骤中，时间的优选范围如下：步骤（a) > 20秒，步骤（b) > 60秒。 步骤（a)较佳的20-120S，更佳25-80s，最佳35-60s ;步骤（b)较佳的60-300S，更 佳 60-150s，最佳 100-150s。 在另一优选例中，所述的核酸分子包括DNA、RNA、或DNA-RNA杂合分子。 在另一优选例中，所述扩增体系含有待扩增DNA、dNTP、引物、聚合酶和镁离子。 在另一优选例中，在步骤（a)和/或（b)中，通过添加碱性溶液或酸性溶液来调节 扩增体系的pH值。 在另一优选例中，通过向扩增体系中添加碱性溶液调节扩增体系的pH值至 ρΗΙΟ-14。 在另一优选例中，所述的碱性溶液包括：NaOH溶液、K0H、Ca(0H)2等强碱性溶液，以 及BR缓冲液（pH = 11?14)、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液（pH = 10?12)等能够将反 应体系pH值调节至碱性（pH > 10)的缓冲液。 在另一优选例中，通过向扩增体系中添加酸性溶液调节扩增体系的pH值至 pH5_8。 在另一优选例中，所述的酸性溶液包括：HC1溶液、H2S04溶液、ΗΝ0 3溶液，Η3Ρ04溶 液等强酸溶液，以及BR缓冲液（pH = 0?3)、磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液 等能够将反应体系pH值调节回中性的缓冲液。 在另一优选例中，所述方法还包括：通过电化学方法调控扩增体系的pH值。 在另一优选例中，所述的步骤（a)和/或（b)中，还包括通过电化学法测定扩增体 系的电位，从而测得扩增体系的pH值。 在另一优选例中，所述的步骤（a)、和/或（b)中，还包括通过电化学法调节扩增体 系的电位，从而调节扩增体系的pH值。 在另一优选例中，所述的扩增核酸的方法为聚合酶链反应方法（PCR)。 在另一优选例中，所述的核酸聚合酶为具有DNA聚合酶活性的酶类，较佳地，所述 的核酸聚合酶包括：大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段（DNA聚合酶I大片段）、大肠杆菌 DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、DNA聚合酶a、DNA 聚合酶β、DNA聚合酶γ、DNA聚合酶δ、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合 酶、Vent DNA 聚合酶、Bca Best DNA 聚合酶、Sac DNA 聚合酶、Iproof DNA 聚合酶、KOD DNA 聚合酶、Phusion DNA 聚合酶、UlltraPF? DNA 聚合酶、LA Tag DNA 聚合酶、Super Tag DNA 聚合酶。 在另一优选例中，所述的核酸聚合酶耐受pH5_14。 在另一优选例中，所述的核酸聚合酶耐受PH6-9。 在另一优选例中，在步骤（b)中还包括补加核酸聚合酶的步骤。 在另一优选例中，核酸聚合酶的加入量为10U/循环周期。 本专利技术的第二方面，提供了一种扩增核酸的设备，所述设备包括： (3i)用于放置进行核酸扩增反应的容器的装置，所述容器用于容纳进行核酸扩增 反应的扩增体系； (3ii)碱性溶液添加装置，所述碱性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加碱性 溶液，从而调节扩增体系的PH至碱性条件； (3iii)酸性溶液添加装置，所述酸性溶液添加装置用于向所述扩增体系添加酸性 溶液，从而调节扩增体系的PH至酸性或中性条件； (3iv) pH测量装置，所述的pH测量装置用于精确控制体系pH值。 在另一优选例中，所述的（i)?（iv)中的一个或多个包括在电化学工作站内。 在另一优选例中，所述的用于放置进行核酸扩增反应的容器的装置为DNA反应芯 片。 在另一优选本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种扩增核酸的方法，其特征在于，所述方法包括：(1a)变性步骤：在pH10‑14的碱性条件下，使得扩增体系中的双链核酸分子解链；(1b)复性和延伸步骤：在pH5‑8的中性和近中性条件下，使得扩增体系中的单链核酸分子与引物进行复性，和在核酸聚合酶存在下，使结合于的单链核酸分子的引物进行延伸，形成扩增的双链核酸分子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张一，刘刚，黄庆，樊春海，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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