一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法。本发明专利技术使用高效液相色谱-二极管阵列检测器和荧光检测器串联测定待测液和对照品溶液，得到相应的峰面积；计算得到芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量。本发明专利技术中待测成分与相邻色谱峰达到基线分离的效果，方法的回收率高，重现性好；能够使芦荟苷A和芦荟苷B的色谱峰被完全分离，可同时准确测定芦荟产品中微量的芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素；本发明专利技术对芦荟苷A的最低检测限LOD达到0.080（ug/mL）；对芦荟大黄素的最低检测限LOD达到0.010（ug/mL）。可以很好的满足目前芦荟产业对芦荟食品、化妆品中微量芦荟苷与芦荟大黄素的同时检测。

【技术实现步骤摘要】
一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法
本专利技术涉及芦荟苷和芦荟大黄素检测的
，更具体地，涉及一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法。
技术介绍
现有研究表明蒽醌类化合物是芦荟的主要药效成分。其中芦荟苷是芦荟的标志性成分，它具有致泻、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗糖尿病等活性，2010年版《中华人民共和国药典》将芦荟苷作为芦荟药材的质控成分，此外芦荟苷有一定的细胞毒性，在食品和保健品中芦荟苷则是一种限制性成分，因此芦荟苷成为评价芦荟品质优劣以及安全性的重要指标。但是，芦荟苷在溶液状态下很不稳定，最近我们的研究表明芦荟苷溶解于水后很不稳定，会立即发生分解与聚合，在中性（pH7.0）、室温条件下600ug/mL浓度的芦荟苷溶液1天后，芦荟苷降解了近50%，5天降解90%以上，在该条件下降解产物经分析鉴定为芦荟大黄素与elgonica-dimer，经细胞毒理MTT实验，结果表明后二者毒性远大于芦荟苷，也就是说，芦荟提取物配成水溶液放置后芦荟苷的量在不断降低，芦荟大黄素与elgonica-dimer在不断增加，因此仅仅对芦荟苷的含量进行测定无法满足对产品有效性和安全性的质量控制。对于芦荟产品，科学可靠的质量控制方法应该同时测定其中芦荟苷和芦荟大黄素的含量，以保证芦荟产品的安全有效，因此芦荟苷、芦荟大黄素高灵敏度同时测定的方法成为芦荟产品质量控制的关键技术。另外，对于芦荟产品，国际芦荟科学委员会（IASC）建议其中芦荟苷含量不超过10ppm，因此芦荟产品中所含芦荟苷和芦荟大黄素含量很低，有的产品中芦荟苷含量可能低于1ppm，因此需要建立一种灵敏度高（低于1ppm）、专属性强、样品前处理简单、操作简便，同时进行芦荟苷和芦荟大黄素含量测定的方法。目前，芦荟苷和芦荟大黄素的含量测定方法主要都有紫外-可见分光光度法、荧光光度法、电化学分析法、薄层扫描法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱联用法；同时测定这两个化合物的方法主要有高效液相色谱法、电化学分析方法和高效液相色谱-质谱联用的方法。气质联用和液质联用可以有效的提高检测方法的灵敏度，但是气质联用需要复杂的衍生化过程，检测成本高，较为简便的方法中如电化学方法又存在重现性较差的问题，紫外可见分光光度法则专属性不强，灵敏度不高，荧光光度法的虽然灵敏度高但与紫外可见分光光度法类似专属性不强，很难排除芦荟产品中其它蒽醌和色酮类成分的干扰。植物体中芦荟苷是以一对光学异构体芦荟苷A和芦荟苷B存在，然而上述检测方法在芦荟苷的测定中是往往仅测定了芦荟苷A的含量，漏掉了芦荟苷B的量，这主要存在以下原因，首先现有检测方法的存在色谱峰分离度不够高，易受其他蒽醌和色酮类成分的干扰；再者目前市场上供应的芦荟苷含量测定对照品仅有芦荟苷A，因此上述检测方法对芦荟苷的测定中是往往仅测定了芦荟苷A的含量，漏掉了芦荟苷B的量。这也就影响了现有检测方法的检测结果的准确性和可靠性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有微量芦荟苷和芦荟大黄素同时检测的技术问题，提供一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法。本方法大大提高了芦荟大黄素检测的灵敏度和保证了芦荟苷含量检测结果的准确性和可靠性。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法，采用色谱条件为：使用规格为250mm×4.6mm、5µm的AgilentTC-C18色谱柱；流动相为乙腈和超纯水；梯度洗脱程序为0至21min，20%~26%乙腈、21至35min，26%~45%乙腈、35至50min，45%~55%乙腈；每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10min；柱温为32～37℃，进样量为20μL，流速为1.0mL/min；二极管阵列检测器的检测波长为356nm；荧光检测器的检测波长为λex=428nm，λem=520nm；所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法，包括以下步骤：S1.按现有方法制备待测液与对照品溶液；S2.含量的测定：采用高效液相色谱-二极管阵列检测器和荧光检测器串联测定S1中的待测液和对照品溶液，得到相应的峰面积；采用色谱条件为：使用规格为250mm×4.6mm、5µm的AgilentTC-C18色谱柱；流动相为乙腈和超纯水；梯度洗脱程序为0至21min，20%~26%乙腈、21至35min，26%~45%乙腈、35至50min，45%~55%乙腈；每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10min；柱温为32～37℃，进样量为20μL，流速为1.0mL/min；二极管阵列检测器的检测波长为356nm；荧光检测器的检测波长为λex=428nm，λem=520nm；S3.根据S2中得到的待测液和对照品溶液的峰面积计算得到待测样品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量；所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。本专利技术中，流动相的乙腈和超纯水按体积比混合。芦荟大黄素在一定的激发波长下能发出较强的荧光，采用荧光检测器可以大大提高其检测灵敏度。本专利技术采用高效液相色谱-二极管阵列检测器串联荧光检测器的方法对低含量或微量的芦荟苷和芦荟大黄素进行检测，实现了芦荟苷和芦荟大黄素同时检测的目的，本方法还可排除样品中其他不会产生荧光物质的干扰，使其芦荟大黄素的检测专属性更强，其检测限可以比现有紫外检测法高出二个数量级。芦荟苷A和芦荟苷B是一对异构体，如果没有合适的条件很难将其分离，而且这两种物质的峰重叠在一起往往是不规整的叠加，即使将其分离，也有可能因为基线分离不好，而导致难以准确计算其积分峰面积，使测量结果不准确。专利技术人发现，由于库拉索芦荟中除了芦荟苷、芦荟大黄素外，还有很多其他成分，其极性分布广，其中不少成分与芦荟苷A和B极性相近似、不少成分与芦荟大黄素极性相似，因此在洗脱时需要在本申请所限定的条件下缓慢的提高有机相的比例，才能保证芦荟苷A和芦荟苷B、芦荟大黄素有良好的分离度，并且使基线平整，为准确地测量待测物中芦荟苷的含量提供可能。另外，现有技术中也有通过色谱柱及流动相的选择实现芦荟苷A和芦荟苷B的分离，但是流动相中通常需要采用乙酸，乙酸对色谱柱存在腐蚀性，长期使用会降低普通色谱柱寿命，要么需要选用一些耐pH值更好的色谱柱，这样会增加成本。而本申请中，仅使用乙腈水溶液即能很好地实现分离，乙腈不会腐蚀色谱柱，因此可以相对地延长色谱柱寿命，也可以减少对色谱柱的要求。由于芦荟中的蒽醌类成分极性比较大，常规提取方法多采用低级醇类，如甲醇、乙醇是比较适合的溶剂。甲醇的提取速度快，没有区分效应，可以将样品中的化学成分全面提取，不易丢失成分。优选地，S1为往芦荟待测物中加入甲醇，再经超声处理后过滤，得到待测液；分别往芦荟苷A和芦荟大黄素的对照品中加甲醇溶解，得到芦荟苷A和芦荟大黄素的对照品溶液。由于存在着芦荟苷A和芦荟大黄素的标准对照品，因此本专利技术中S3为根据S2中得到的对照品溶液的峰面积绘制标准曲线，并根据标准曲线计算得到待测样品中芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素的含量。本专利技术使用标准曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效液相色谱‑二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法，其特征在于， 采用色谱条件为：使用规格为250 mm×4.6 mm、5 µm 的Agilent TC‑C18色谱柱；流动相为乙腈和超纯水；梯度洗脱程序为0至21 min，20%~26%乙腈、21至35 min，26%~45%乙腈、35至50 min，45%~55%乙腈；每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10 min；柱温为32～37℃，进样量为20 μL，流速为1.0 mL/min；二极管阵列检测器的检测波长为356 nm；荧光检测器的检测波长为λex=428 nm，λem=520 nm；所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。

【技术特征摘要】
1.一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法，其特征在于，采用色谱条件为：使用规格为250mm×4.6mm、5µm的AgilentTC-C18色谱柱；流动相为乙腈和超纯水；梯度洗脱程序为0至21min，20%~26%乙腈、21至35min，26%~45%乙腈、35至50min，45%~55%乙腈；每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10min；柱温为32～37℃，进样量为20μL，流速为1.0mL/min；二极管阵列检测器的检测波长为356nm；荧光检测器的检测波长为λex=428nm，λem=520nm；所述芦荟样品为库拉索芦荟的制品。2.一种高效液相色谱-二极管阵列/荧光检测器串联检测芦荟样品中芦荟苷A、B和芦荟大黄素的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.按现有方法制备待测液与对照品溶液；S2.含量的测定：采用高效液相色谱-二极管阵列检测器和荧光检测器串联测定S1中的待测液和对照品溶液，得到相应的峰面积；采用色谱条件为：使用规格为250mm×4.6mm、5µm的AgilentTC-C18色谱柱；流动相为乙腈和超纯水；梯度洗脱程序为0至21min，20%~26%乙腈、21至35min，26%~45%乙腈、35至50min，45%~55%乙腈；每次进样之间以初始流动相比例平衡色谱柱10min；柱温为32～37℃，进样量为20μL，流速为1.0mL/min；二极管阵列检测器的检测波长为356nm；荧光检测器的检测波长为λex=428nm，λem=520nm；S3.根据S2中得到的待测液和对照品溶液的...

【专利技术属性】
技术研发人员：万金志，丁雯静，钟英，董银卯，王巧娥，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44