一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法技术

本发明专利技术公开了一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，包括如下步骤：S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物；S2、提取溶藻弧菌基因组DNA；S3、以溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增；S4、取PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小；S5、将PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后，通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E.coli DH5a菌株。本发明专利技术成功构建OmpK表达载体，确定OmpK蛋白菌株的最佳表达条件与培养条件，为OmpK工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种原核载体构建方法，具体涉及一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法。 
技术介绍
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，V.alginolyticus)为革兰阴性菌，分布于海域、河口地区，可引起水产鱼类败血症和胃肠炎，造成大量死亡，严重影响水产养殖业的发展；也可引起人类胃肠道疾病与伤口感染；是一种人和海洋动物共感染的病原菌。 溶藻弧菌外膜蛋白(Outer membrance proteins，OMPs)是外膜的重要组成部分，在感染和诱导宿主免疫反应上起重要作用；其中外膜蛋白K(Outer membrance protein K，OmpK)为溶藻弧菌主要的外膜蛋白，在不同弧菌间具有序列保守性，存在交叉免疫反应，是弧菌间共同抗原的分子基础。此外，OmpK对弧菌感染具有很好的免疫保护作用，在疫苗上有很好的应用前景。 
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，并对OmpK蛋白发酵的实验室小试条件进行研究。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为： 溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，包括如下步骤： S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primer1：5’-ACA GGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3’；Primer2：5’-ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3’； S2、提取溶藻弧菌基因组DNA； S3、以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增； S4、取S3中的PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小； S5、将S3中的PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后，通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E.coli DH5a菌株，提取重组质粒后，进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，并对重组质粒进行测序测定，与步骤S1所设计的基因引物进行对比，转化重组质粒入E.coli BL21表达菌株。 优选的，所述步骤S3中PCR扩增条件为：PCR扩增采用50μL反应体系，反应缓冲液5μL，基因组模板3μL，10mmol/L dNTP2μL，25umol/L引物各1.5μL，Taq酶0.5μL，补水至50μL。 PCR扩增反应条件为：94℃变性3min；30个循环：94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸60s；72℃延伸10min，最后4℃保温。 其中，本专利技术通过选用L9(34)正交试验，得出了OmpK菌株最佳诱导表达条件为：诱导时菌液OD600值0.8，加IPTG终浓度0.3mmol/L，诱导时间8h，温度32℃；最佳培养条件为：转速230rpm，葡萄糖浓度0％，装液量50mL。 本专利技术的有益效果如下： 上述方案中，成功构建OmpK表达载体，确定OmpK蛋白菌株的最佳表达条件与培养条件，为OmpK工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。利用切胶纯化蛋白方法获得OmpK蛋白，免疫小鼠，制备多克隆抗体，再通过ELISA与Wester-Blotting方法检测多抗的效价与特异性。并通过L9(34)正交试验设计，筛选OmpK工程菌最佳表达与培养条件。 附图说明图1为溶藻弧菌ompK基因重组质粒构建对比图。 A：PCR扩增ompK基因：1，阴性对照；2，ompK基因；B：BamH I与Xho I双酶切检测ompK基因重组质粒：1，ompK重组质粒；2，ompK重组质粒BamH I+Xho I双酶切。 图2为OmpK蛋白表达与纯化图。 M，Protein marker；1，未诱导菌株；2，IPTG诱导菌株；3，OmpK蛋白纯化。 图3为OmpK多克隆抗体效价的测定结果图。 图4为OmpK多克隆抗体特异性的Western-Blotting检测结果图。 A，1∶400倍稀释的抗血清；B，1∶800倍稀释的抗血清；C：1∶1600倍稀释的抗血清；D：1∶400倍稀释的阴性对照血清。 图5为OmpK菌株IPTG诱导的正交试验结果图。 M：Protein marker；1-3：IPTG诱导3h，诱导温度为28℃、32℃、37℃；4-6：IPTG诱导8h，诱导温度为28℃、32℃、37℃；7-9：IPTG诱导12h，诱导温度为28℃、32℃、37℃。 具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。 本专利技术实施例中的试验材料：溶藻弧菌，E.coli BL21菌株，E.coli DH5a菌株，pET-32a质粒本实验中心保存；昆明鼠购于西安交通大学实验动物中心；引物合成由西安沃尔森生物技术有限公司完成。 主要试剂：Taq酶，限制性内切酶，T4-DNA连接酶，NDA Marker，Protein Marker，均为Takara公司产品；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒为上海生物工程公司；IPTG、蛋白胨，酵母粉购于美国MP公司；二抗购于Sigma公司， 其它试剂均为分析纯。 本专利技术实施例提供了一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，包括如下步骤： S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primer1：5’-ACA GGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3’；Primer2：5’-ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3’；下划线为限制性内酶位点BamH I和Xho I。 S2、提取溶藻弧菌基因组DNA； S3、以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增； S4、取S3中的PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小； S5、将S3中的PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后，通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E.coli DH5a菌株，提取重组质粒后，进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，并对重组质粒进行测序测定，与步骤S1所设计的基因引物进行对比，用BamH I和Xho I双酶切重组质粒获得约800bp片段，与目的基因大小一致，序列测序结果证实与NCBI公布的基因序列相同，证明成功构建重组质粒，转化重组质粒入E.coli BL21表达菌株。 取经鉴定正确的重组菌株过夜培养，以1∶100倍转接入新鲜的LB培养基中，待OD600约0.6时，加入终浓度0.5mM IPTG，37℃诱导培养5h，收集菌体，蛋白电泳检测OmpK蛋白表达情况；并利用SDS-PAGE电泳切胶的方法，对OmpK蛋白进行纯化。为检测重组蛋白的表达情况，将OmpK表达菌株经IPTG诱导后，蛋白电泳获得约50kDa的蛋白条带，包含OmpK约30kDa，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primer1：5’‑ACAGGATCCATGCGTAAATCACTTTT‑3’；Primer2：5’‑ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC‑3’；S2、提取溶藻弧菌基因组DNA；S3、以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增；S4、取S3中的PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小；S5、将S3中的PCR扩增产物与pET‑23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后，通过T4‑连接酶将目的基因插入pET‑32a质粒中，转化E.coli DH5a菌株，提取重组质粒后，进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，并对重组质粒进行测序测定，与步骤S1所设计的基因引物进行对比，转化重组质粒入E.coli BL21表达菌株。

【技术特征摘要】
1.溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，其特征在于，包括如下步
骤：
S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primer1：5’-ACA
GGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3’；Primer2：5’-ACTCTCGAGTTAGAATT
TGTAAGTTAC-3’；
S2、提取溶藻弧菌基因组DNA；
S3、以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增；
S4、取S3中的PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小；
S5、将S3中的PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切
后，通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘祥，陈春琳，俱雄，
申请(专利权)人：陕西理工学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61