一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法技术

一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法，包括如下步骤：（1）壳聚糖磁性纳米粒子的制备；（2）磁性纳米粒子表面氨基化处理；（3）氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键，普鲁兰酶被固定。与传统的固定化普鲁兰酶相比较，本发明专利技术首次采用壳聚糖水凝胶诱导法制备的载体用来固定化普鲁兰酶，较传统方法步骤简单，条件温和，为一种环境友好型的绿色方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法，包括如下步骤：（1）壳聚糖磁性纳米粒子的制备；（2）磁性纳米粒子表面氨基化处理；（3）氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键，普鲁兰酶被固定。与传统的固定化普鲁兰酶相比较，本专利技术首次采用壳聚糖水凝胶诱导法制备的载体用来固定化普鲁兰酶，较传统方法步骤简单，条件温和，为一种环境友好型的绿色方法。【专利说明】
本专利技术涉及酶工程
，尤其是涉及一种利用水凝胶诱导方法制备的壳聚糖 磁性纳米粒子来固定普鲁兰酶的新方法。
技术介绍
普鲁兰酶（Pullulanase，EC 3. 2. 1.41)是一种脱支酶，在以淀粉为原料的食品加 工业中有着重要的用途，其能将最小单位的支链分解，最大限度的利用淀粉原料。目前在工 业中主要是应用在提高高葡糖浆及超高麦芽糖浆的产量和纯度；提高啤酒糖浆的麦芽糖含 量；增加马铃薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉中抗消化淀粉的含量以及生产高直连淀粉等。 与游离的酶相比，固定化酶具有很多优点，所以近几十年来关于各种固定化酶技 术和载体材料的研究应运而生。与传统的材料相比，磁性纳米颗粒是一种新型的复合材料， 具有超顺磁性及良好的生物相容性，使其在生物、医药和环保领域有着广泛的应用。用磁性 纳米颗粒为载体固定化酶，可实现在外加磁场下快捷的与产物分离，使工业化连续化生产 成为可能，且分离比较彻底，简化了后续的产物分离过程，因此磁性纳米颗粒作为载体固定 化酶的研究成为生物催化领域的热点。 近年来，最普遍使用的磁性纳米粒子是磁性四氧化三铁纳米粒子。然而，由于其自 身的不稳定性，它们在水溶液中容易发生聚集，导致使用价值降低。研究表明，在磁性纳米 颗粒表面包裹一层生物相容性聚合物可以达到提高其稳定性，减少聚集的作用。壳聚糖是 除了纤维素、淀粉外生物界广泛存在的第三大类生物相容性天然聚合物大分子，由于其无 毒性，可降解性以及粘附性，引起了越来越多的关注，已应用在金属吸附、固定化酶、蛋白质 吸附和药物的控制释放等行业；并且壳聚糖表面还有大量功能性基团，如氨基，羟基等，是 进行酶固定化的良好载体。研究报道已有一些酶固定在壳聚糖/四氧化三铁纳米颗粒上， 并取得了较为理想的效果。 目前，磁性壳聚糖/四氧化三铁纳米粒子的合成主要是采用微乳液及乳液聚合 法，但这些合成方法仍然存在工艺繁琐，条件苛刻(较高温度和压力、需保护气氛、有机溶剂 和有机表面活性剂等）的问题；并且这些合成方法大多是在水/油系统中进行，然而由于大 多数实际生产采用的是水系统，因此这也可能会限制其在实际生产中的应用。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本 申请人:提供了一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普 鲁兰酶的方法。与传统的固定化普鲁兰酶相比较，本专利技术首次采用壳聚糖水凝胶诱导法制 备的载体用来固定化普鲁兰酶，较传统方法步骤简单，条件温和，为一种环境友好型的绿色 方法。 本专利技术的技术方案如下： 一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法，包括如下步骤： (1)壳聚糖磁性纳米粒子的制备； (2)磁性纳米粒子表面氨基化处理； (3 )氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键，普鲁兰 酶被固定。 具体步骤为： (1) 壳聚糖磁性纳米粒子的制备方法： 将壳聚糖粉末加入到乙酸溶液中，配制成质量百分比浓度为3~5%均一的淡黄色壳 聚糖溶液；将浓度为25%的戊二醛溶液缓慢加入到上述壳聚糖溶液中，继续匀速搅拌 15?30min，再静置12?24h，得到壳聚糖水凝胶；将水凝胶依次浸泡在0· 05?0· 2mol/L Fe3+的 水溶液、水、0.02~0. lmol/L Fe2+的水溶液中，循环四次；然后将含有铁离子的壳聚糖水凝胶 浸泡在1~1.5 mol/L的NaOH溶液中碱化处理12~24h，得到黑色的水凝胶，将此水凝胶采用 乙酸及过氧化氢溶液水解即得到黑色的具有磁响应的纳米粒子，在外加磁场下收集磁响应 物质，然后用蒸馏水漂洗至中性；所得到的磁性纳米粒子分散性良好，直径在5~12nm左右； (2) 磁性纳米粒子表面氨基化处理的方法： 称取已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子，于甲醇或甲苯溶液中超声分散0. 5~1. 5 h，然后 再将溶液调为碱性，在机械搅拌下缓慢加入硅烷偶联剂，50°C下搅拌反应4~8h;反应后的 产物用磁场收集，分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次，洗涤过的固体在室温下干燥，得到 氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子； (3) 氨基化处理后的磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法： 将干燥的氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子超声分散在磷酸缓冲液中，振荡3~5小时，经 磁场分离，然后再分散到磷酸缓冲溶液中，于室温搅拌反应条件下缓慢加入交联剂溶液，搅 拌反应l~15h，再在外加磁场下收集磁性纳米粒子，并用去离子水多次洗涤以除去残留的交 联剂；处理好的载体按1:2~1:4 (mg:ml)的比例加入到普鲁兰酶溶液中，于25~40°C水浴振 荡器中，振荡固定12~36h ;所述普鲁兰酶溶液的浓度为15~50μ g/mL，pH值为3. 5~5. 4。 步骤（1)中所述戊二醛溶液的用量为每100ml乙酸溶液中加入0. 2?lml。步骤（2) 中所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3- (2-氨基乙基氨基）丙基甲基二甲氧 基娃烧。 步骤（2)中所述已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子与硅烷偶联剂的比例为 18:11111?18 :81111。步骤（2)、（3)中，使用似0!1、1(0!1、似!1〇)3或氨水将溶液调为碱性。 步骤（3)中所述普鲁兰酶的浓度为50μ g/mL。步骤（3)中所述交联剂为戊二醛、 碳二亚胺或环氧氯丙烷中的至少一种；加入交联剂后溶液中戊二醛的浓度为〇. 5~15%，碳 二亚胺的浓度为l(T2〇〇mM，环氧氯丙烷的浓度为5?15%。 步骤（3)中使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时，加入硼氢化钠或氰基硼氢化 钠后再震荡反应lh。使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时，加入硼氢化钠或氰基硼氢化 钠，将酶与载体形成的亚胺还原为更为稳定的伯胺；加入的硼氢化钠或氰基硼氢化钠与普 鲁兰酶液的比例为0. 5:f3:l (mg:ml)。 本专利技术有益的技术效果在于： 本专利技术克服了以往固定化磁性材料制备繁杂、成本高、团聚严重、固定化效率不高、制 备过程复杂的缺点，提供的普鲁兰酶固定化的方法保留酶活高且稳定性好。本专利技术中主要 通过壳聚糖表面的氨基基团与溶液中的铁离子发生螯合作用，诱导四氧化三铁晶体的形 成，然后将壳聚糖水凝胶进行水解，就可以得到分散性较好、纳米级别的壳聚糖包裹的四氧 化三铁纳米粒子。 本专利技术提供的壳聚糖载体具有良好的生物相容性及分散性，该载体表面存在大量 的官能团，酶分子能与载体充分的结合，制备出的固定化酶便于回收利用。这种水凝胶诱导 无机合成为磁性纳米粒子的制备提供了新途径，是一种步骤简单、环境友好型的绿色方法。 由于普鲁兰酶做为一种重要的工业用酶，提高其稳定性具有较大的经济意义，因 此本专利技术通过将普鲁兰酶固定在水凝胶诱导的壳聚糖磁性纳米粒子上，使得所得的酶具有 较高的热稳定性及重复使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）壳聚糖磁性纳米粒子的制备；（2）磁性纳米粒子表面氨基化处理；（3）氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键，普鲁兰酶被固定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金征宇，龙杰，焦爱权，徐学明，谢正军，田耀旗，周星，赵建伟，杨哪，王金鹏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32