弗尼斯弧菌检测用引物对、试剂盒及检测方法技术

弗尼斯弧菌检测用引物对、试剂盒及检测方法。所述引物对碱基序列为SEQ ID NO.1/2。本发明专利技术进一步公开了包含上述引物对的试剂盒及应用上述引物对进行PCR检测的弗尼斯弧菌检测方法。本发明专利技术的引物特异性强，检测试剂盒及方法简便易用，结果准确，具有很高的特异性和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食源性病原菌的快速检测方法，尤其涉及利用PCR技术检测样品中弗尼斯弧菌的方法。还涉及检测所使用的特异性引物序列和检测试剂盒。
技术介绍
弧菌作为近海河口环境中微生物区系的成员，广泛分布于自然水域及渔业生物中，是引发人类细菌性疾病的主要病原菌之一。人们通过饮用不清洁水、食用未加工或未加工熟的带有致病性弧菌的食物，特别是海产品容易感染发病。弧菌属中霍乱弧菌(Vibr1.cholerae)、副溶血性弧菌(Vibr1 parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibr1vulcificus)、河弧菌(Vibr1 fluvialis)、拟态弧菌(Vibr1 minicus)、麦氏弧菌(Vibr1metschnikovii)、霍利斯弧菌(Vibr1 hollisae)、溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus)、弗尼斯弧菌(Vibr1 furnissii)、海鱼弧菌(Vibr1 damsela)、辛辛那提弧菌(Vibr1cincinatiensis)和S鱼弧菌(Vibr1 carchariae) 12个种为人潜在肠道致病菌。由弗尼斯弧菌引起的急性胃肠炎首先发现于日本及东方一些国家，其后扩散至西方国家，通常呈爆发流行或散发性急性胃肠炎。弗尼斯弧菌能产生肠毒素，为旅游者腹泻的病原菌之一，临床上以腹泻及腹痛为主，并伴随有恶心及呕吐等症状，也有严重致死病例报。 快速、准确的检测食品中致病菌是有效预防和控制病原菌感染的重要保障，但是目前国内外现有的检测方法中，对弗尼斯弧菌的检测只有常规的病原菌分离培养法，该方法不仅费时费力，无法满足快速高通量检测病原菌的要求；再加上弧菌属细菌生化反应相对不稳定，给鉴定工作带来了很多困难和不确定性，容易出现假阴性和假阳性结果，影响检测结果质量，并且会带来较大的经济损失。随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的快速诊断，该方法不仅敏感、准确，而且快速、高通量，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测病原菌的方法，但现有技术中还未见有针对弗尼斯弧菌检测的PCR技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可快速、准确、灵敏地检测食品和水产品样品中弗尼斯弧菌的PCR检测方法。 为实现上述目的，本专利技术首先提供一种弗尼斯弧菌检测用引物对，其碱基序列为SEQ ID N0.1/2。 正向引物(SEQID N0.1):5/ -CAATCCAAGATGGTCACGCTAA-3'， 反向引物(SEQID N0.2):5/ -TTTATCCACCGCGTACAGCTT-3'。 另一方面，本专利技术提供一种弗尼斯弧菌检测用试剂盒，所述试剂盒是PCR检测试剂盒，其中包括碱基序列为SEQ ID N0.1/2的引物对。 作为优选，该试剂盒中还包括用于PCR检测的阳性对照模板，所述阳性对照模板为浓度为lOnmol/L~lOOnmol/L的弗尼斯弧菌标准菌株的DNA提取物。所述试剂盒在检测应用中，可以使用其它任意非弗尼斯弧菌DNA提取物为阴性对照模板，并使用双蒸水为空白对照。 本专利技术的再一目的在于提供一种弗尼斯弧菌的检测方法，所述方法为PCR检测方法，其包括以SEQ ID N0.1/2为引物对进行PCR扩增的步骤。 上述本专利技术的弗尼斯弧菌的检测方法的检测对象是食品和水产品样品，目的在于检查待测样品中是否存在弗尼斯弧菌。该方法中，PCR扩增以弗尼斯弧菌ToxS基因(GenBank登陆号CP002377.1)的112~261位的核酸序列为靶基因，以SEQ ID N0.1/2所示的引物对，通过PCR选择性扩增所述靶基因，并检测确认是否存在有扩增产物。 更为具体地，上述本专利技术的的的弗尼斯弧菌检测方法，包括如下步骤: ⑴提取待测样品DNA，得到模板液； (2) PCR 扩增: 反应体系:模板液2μ 1U0XPCR缓冲液2μ L、dNTP0.4μ L、Taq酶1U、浓度为10 μ M的引物对SEQ ID N0.1/2各0.5 μ L、补充灭菌双蒸水至总体积为20 μ L ;以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min离心1s ； 反应条件:94°C预变性4min,然后 94°C lmin、59°C lmin、72°C lmin, 35 个循环,最后72°C延伸10min，4°C保存； ⑶PCR扩增产物电泳检测: 用电泳缓冲液制备I %琼脂糖凝胶，取步骤⑵所制备的PCR扩增产物6 μ L，与 Iμ L上样缓冲液混合后点样，用DNA分子量标记物做参照；3V/cm~5V/cm恒压电泳，电泳20min~40min,电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存； ⑷结果判定:以弗尼斯弧菌标准菌株作为阳性对照，以其它非弗尼斯菌株作为阴性对照，以灭菌双蒸水为模版作为空白对照进行步骤⑴~⑷的操作； 如待测样品扩增片断大小与阳性对照一致即可判定为阳性，若样品无扩增产物或者产物片段大小不一致即可判定为阴性，阳性扩增片段需进行测序并与参考序列进行比对； 本专利技术检测条件下:阳性对照的PCR扩增产物为150bp，阴性对照和空白对照无扩增产物。 【具体实施方式】中，步骤⑴模板液的制备方法可以从现有技术中简单获取，对本领域技术人员来说，确定模板液中DNA浓度及保证检测样品符合标准是无需花费创造性劳动的，本专利技术中使用DNA浓度为lOnmol/L~lOOnmol/L的模板液进行PCR扩增。 具体地，以保藏菌株为原材料制备模板液可以使用下述方法:待测样品用3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养后，取1.0mL培养液于13000rpm离心2min，弃上清液，用DNA提取试剂盒处理得模板液；或者向1.0mL培养液中加入20 μ L~30 μ L灭菌双蒸水振荡混匀后煮沸5min，再取2 μ L上清液做模板液。上述增菌培养时间一般需要8h~18h至菌浓度约0.5麦氏浊度时，所得的模板液满足反应测量的要求。 使用本专利技术的方法，尤其是特异性引物进行PCR扩增检测，与经典方法的细菌培养、分离、鉴定方法相比，本专利技术的方法更快速、准确。且较传统方法特异性强，灵敏度高，对弗尼斯弧菌检测特异性为100%，检测灵敏度为2400CFU/mL。 【附图说明】 本专利技术附图3幅: 图1是弗尼斯弧菌特异性检验结果，其中:l、20:Marker DL2000 ;2、3、4、5、6、7:弗尼斯弧菌DNA PCR产物；8:水对照；9、10:霍乱弧菌DNA PCR产物；11、12:副溶血性弧菌DNAPCR产物;13、14:溶藻弧菌DNA PCR产物;15、16:创伤弧菌DNA PCR产物;17、18:拟态弧菌DNA PCR产物；19:水对照。 图2是弗尼斯弧菌特异性检验结果，其中:1、24 =Marker DL2000 ;2、3:河弧菌DNAPCR产物；4、5:霍利斯弧菌DNA PCR产物；6、7:鲨鱼弧菌DNA PCR产物；8、9:海鱼弧菌DNAPCR产物;10、11:麦氏弧菌DNA PCR产物;12、13:嗜水气单胞菌DNA PCR产物;14、15:大肠杆菌DNA PCR产物；16、17:志贺氏菌DNA PCR产物；18、19:金黄色葡萄球菌DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
弗尼斯弧菌检测用引物对，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO.1/2。

【技术特征摘要】
1.弗尼斯弧菌检测用引物对，其特征在于，碱基序列为SEQID N0.1/2。2.弗尼斯弧菌检测用试剂盒，包括碱基序列为SEQID N0.1/2的引物对。3.根据权利要求2所述的弗尼斯弧菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括浓度为10~lOOnmol/L的弗尼斯弧菌标准菌株的DNA提取物。4.一种弗尼斯弧菌的检测 方法，其特征在于，所述方法包括以SEQ ID N0.1/2为引物对进行PCR扩增的步骤。5.权利要求4所述的弗尼斯弧菌的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增以弗尼斯弧菌ToxS基因112~261位的核酸序列为靶基因。6.权利要求5所述的弗尼斯弧菌的检测方法，其特征在于，所述的ToxS基因的GenBank 登陆号 CP002377.1。7.权利要求4所述的弗尼斯弧菌检测方法，包括如下步骤: ⑴提取待测样品DNA，得到模板液； ⑵PCR扩增: 反应体系:模板液2μ 1U0XPCR缓冲液2yL、dNTP0.4yL、Taq酶1U、浓度为10 μ M的引物对SEQ ID N0.1/2各0.5 μ L、补充灭菌双蒸水至总体积为20 μ L ;以上各组分加入至.0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min离心1s ； 反应条件:94°...

【专利技术属性】
技术研发人员：王殿夫，高世光，麻丽丹，黄大亮，腾艳霞，
申请(专利权)人：王殿夫，高世光，麻丽丹，黄大亮，腾艳霞，
类型：发明
国别省市：辽宁;21