北冬虫夏草菌种培养方法技术

一种可以代替冬虫夏草入药、能代替天然冬虫夏草药源的北冬虫夏草菌种培养方法。技术方案是包括下列步骤：（1）母种制备；（2）母种转原种和栽培种；（3）悬浮液菌种或/液体菌种的制备；（4）北冬虫夏草菌种的人工栽培。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于领域，尤其是一种北冬虫夏草菌种培养方 法。
技术介绍
冬虫夏草是我国特有的一类珍贵药材，具有极高的医疗保健价值加经济价值，在 国内外享有盛誉，素有东方传奇式珍宝之美称，是我国传统的出口创汇商品，所以，冬虫 夏草是我国传统医药宝库中的一朵奇葩。 唯有冬虫夏草的医疗保健价值及经济价值最高，所以在国内外真菌界、医药界、食 品界、生物界等多年来致力于研究开发的重点。冬虫夏草具有抗疲劳、耐缺氧、抗衰老、抗 肿瘤以及提高人体免疫功能等多种医疗保健作用。对人体可起到滋肺补肾、止血化痰、平 喘、扩张气管、镇静抗各类细菌、降血压等作用。冬虫夏草中含有虫草素、冲草酸多种人体必 需氨基酸，有益微量元素的维生素、虫草多糖、超氧化物歧化酶（S0D)等多种营养物质和抗 癌抗衰老的活性物质，主要成份之一虫草素是一种具有抗生作用和抑制细胞分裂作用的物 质，能抑制癌细胞的增生。国内外同位素检测技术对冬虫夏草研究证明冬虫夏草中虫草素 和冲草酸不仅具有补肾壮阳、益精定喘的作用，而且能明显地对抗细胞衰老。 冬虫夏草生长在我国西部与西南部的高寒地区，生长环境特殊，资源有限，随着多 年来国内外的深入研究，进一步认识到冬虫夏草对人体的医疗和滋补研究，进一步认识到 冬虫夏草对人体的医疗和滋补所具有的重要价值，需求不断增加，由于天然冬虫夏草资源 本就不多，加上虫草资源数量锐减，产量不断下降，供求矛盾日益加剧，造成市场供求脱节， 价格昂贵，针对这种情况，投入对冬虫夏草的人工引种驯化，栽培遗传及应用等方面的研究 工作之中，作为一种有发展潜力的新技术新工艺，开辟药源生物发酵技术确实具有重大价 值和发展前途。 由于冬虫夏草生长环境的特殊性，人工培养作为冬虫夏草近缘种的北冬虫夏草受 到了关注。然而，在现有的北冬虫夏草人工培养中，由于北冬虫夏草菌种极其容易退化和衰 老、不易保藏，在栽培实践中导致许多种植户使用同一优良菌种，甚至同样制备和使用液体 菌种，却不出草或很少出草。 在现有的北冬虫夏草人工培养，往往仅仅关注单一步骤的培养基配方和培养条 件，未总体考虑到各个步骤的培养基配方和培养条件，有时导致在某一步骤的培养效果虽 然好，但是却可能影响到后续步骤的培养效果，从而导致总体培养效果较差。 例如，CN1724641A公开了一种北冬虫夏草液体菌种营养基的制备方法及其应用， 它主要通过选取不同的原料，包括胡萝卜、葡萄糖等物料进行充分混合，再加入一定量的连 霉素等，进行发酵，制备得北冬虫夏草液体菌种营养基。然后是在培育北冬虫夏草过程中进 行温度、时间的不同控制，可以达到较好的培育效果。本专利技术的优点在于，营养基的制备方 法简单，操作方便；培养基在北冬虫夏草的培育过程中可以取得较好的效果，缩短时间，温 度控制要求低，遮光要求低等优点。本专利技术的实施，可以有利于北冬虫夏草的大力推广与培 育。然而，在该专利文献中，北冬虫夏草总体培养效果欠佳，如产量不高。 CN101463325A公开了一种北冬虫夏草工厂化栽培方法，经菌种制备、配料装瓶、灭 菌、接种、培养、出草采收步骤工厂化栽培北冬虫夏草，采用了常见的人工代料作为培养材 料，降低了生产成本，而且本专利技术获得的北虫草质量稳定性好，生物转化率高等优点。在该 专利文献，成草率较低。 非专利文献不同氮源对北冬虫夏草生长影响的研究，杨宣华，佛山科学技术学 院学报（自然科学版），第26卷第3期，2008年5月，以硝酸钾，蛋白胨、黄豆粉、硫酸铵、尿 素5种不同氮源对北冬虫夏草的菌球数量、干重，菌丝生长状况及子实体的鲜重和干重进 行研究，认为液体培养的菌球最多的是蛋白胨，其次是黄豆粉，最差是硝酸钾，固体斜面培 养基从菌丝长势来看最好是蛋白胨，最差的是硝酸钾，北冬虫夏草最佳的氮源是黄豆粉。然 而，在专利文献中所述优选氮源对不同菌种的适应性较差。 本专利技术人的在先专利申请CN1935979A公开了一种。然 而，母种稳定性较差，易退化和衰老。 因此，目前亟需一种稳定且有效的北冬虫夏草培养方法。
技术实现思路
本专利技术人经过深入研究，在先前研究的基础上，经过大量筛选和实验，从整体认真 研究了每个培养步骤的培养基配方和培养条件，通过将每一步骤的培养基配方和培养条件 加以总体和协同考虑，提供如下可以代替冬虫夏草入药、能代替天然冬虫夏草药源的北冬 虫夏草菌种培养方法。 本专利技术的技术方案是：，包括下列步骤： (1)母种制备；（2)母种转原种和栽培种；（3)悬浮液菌种或/液体菌种的制备；(4)北 冬虫夏草菌种的人工栽培。 所述的母种制备包括：（1)制作培养基；（2)试管母种制备；（3)试管母种的扩大 培养；(4)出草试验；（5)组织分离制作母种。 所述（1)母种制备制备优选包括：将斜面菌种活化后分割成豌豆大小，每2?3块 接种到一瓶液体培养基中，于25°C、100 r/min振荡培养7天得等级为1的种，将培养好的等 级为1的种以8% (V/V)接种量接种到相同的液体培养基中，在所述等级为1的种相同条件 下培养20天，分别将各菌株胞外液经0. 40 μπι膜过滤后进行虫草素含量测定，每组试验重 复3次，筛选得到所需母种。 所述（2)试管母种制备优选包括采用冬虫夏草的组织直接切取虫草菌核内部的 一小块菌索，〇. 2%升汞溶液和0. 1% ΚΝ03溶液分别表面消毒3 min，无菌水冲洗3?5次， 无菌条件下切去外层、避开肠道，切取内部黑色菌索〇. 4 cm左右，将菌索分别接种到8个基 本培养基中，在三角瓶中进行1?8倍的扩大培养，然后于生化培养箱中20°C静置培养120 h〇 在上述培养基中优选加入占培养基总重量的0. 001%重量的吲哚基丙酸，并维持 培养基的pH为约6. 7,可以使子实体生长良好并且使分化的子实体原基较多。 所述的母种转原种和栽培种包括：（1)培养基的配制、（2)母种转管扩大。 所述的悬浮液菌种制备包括：（1)培养基配制、（2)灭菌、（3)接种培养。 所述的液体菌种制作包括（1)液体菌种培养基配方、（2)接种培养。 所述的北冬虫夏草菌种人工栽培包括：（1)按培养基配方制作培养基，培养基配 方选自以下5种中的任一种或多种： ① 炒大米93%，葡萄糖2 %，蛋白胨2%，柠檬酸0. 29 %，硫酸镁0. 2%，蚕蛹粉2. 5 %， 维生素 B10. 01% ; ② 高粱米85%，蚕蛹粉10%，蔗糖1.99%，蛋白胨2%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸镁 〇. 1%，酵母粉〇. 8%，另加维生素 B10. 01% ; ③ 小米95 %，葡萄糖3. 49 %，酵母膏1. 2 %，磷酸二氢钾0. 1 %，硫酸镁0. 2 %，另加维生 素 B10. 01% ; ④ 高粱米45%，玉米渣40%，小米10%，蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉0. 8%，磷酸二氢 钾0. 1%，硫酸镁0. 1% ; ⑤ 大米50 %，麦麸25 %，玉米粉9. 99 %，葡萄糖（或蔗糖）2 %，木屑10 %，蚕蛹粉2 %， 尿素0. 1%，硫酸镁0. 9%，另加维生素 B10. 01% ; (2)拌料装瓶；（3)灭菌；(4)接种；（5)培养室培养；(6)后期管理；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是包括下列步骤：(1)母种制备；(2)母种转原种和栽培种；(3)悬浮液菌种或/液体菌种的制备；和(4)北冬虫夏草菌种的人工栽培。

【技术特征摘要】
1. 北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是包括下列步骤：（1)母种制备；(2)母种转原种 和栽培种；（3)悬浮液菌种或/液体菌种的制备；和（4)北冬虫夏草菌种的人工栽培。2. 根据权利要求1所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是所述的母种制备包括： (1)制作培养基；（2)试管母种制备；(3)试管母种的扩大培养；(4)出草试验；和（5)组织 分离制作母种。3. 根据权利要求1或2所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其中所述⑴母种制备制备 包括：将斜面菌种活化后分割成豌豆大小，每2?3块接种到一瓶液体培养基中，于25°C、 100 r/min振荡培养7天得等级为1的种，将培养好的等级为1的种以8% ( V/V)接种量接 种到相同的液体培养基中，在所述等级为1的种相同条件下培养20天，分别将各菌株胞外 液经0. 40 μ m膜过滤后进行虫草素含量测定，每组试验重复3次，筛选得到所需母种。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其中所述⑵试管母 种制备包括采用冬虫夏草的组织直接切取虫草菌核内部的一小块菌索，0.2%升汞溶液和 0. 1% ΚΝ03溶液分别表面消毒3min，无菌水冲洗3?5次，无菌条件下切去外层、避开肠道， 切取内部黑色菌索〇. 4 cm左右，将菌索分别接种到8个基本培养基中，在三角瓶中进行1? 8倍的扩大培养，然后于生化培养箱中20°C静置培养120 h ;以及其中，在培养基中加入占培 养基总重量的0. 001%重量的吲哚基丙酸，并维持培养基的pH为约6. 7。5. 根据权利要求1或2所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是： 所述的母种转原种和栽培种包括：（1)培养基的配制；和（2)母种转管扩大； 所述的悬浮液菌种制备包括：（1)培养基配制、（2)灭菌、和（3)接种培养； 所述的液体菌种制作包括：（1)液体菌种培养基配方、和（2)接种培养。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的北冬虫夏草菌种培养方法，其特征是所述的北冬 虫夏草菌种人工栽培包括：（1)按培养基配方制作培养基，培养基配方选自以下5种中的任 一种或多种：①炒大米93%，葡萄糖2 %，蛋白胨2%，柠檬酸0. 29%，硫酸镁0. 2%，蚕蛹粉 2. 5%，维生素 B10. 01 %;②高粱米85%，蚕蛹粉10%，蔗糖1.99%，蛋白胨2%，磷酸二氢钾 0. 1 %，硫酸镁0. 1 %，酵母粉0. 8 %，另加维生素 B10. 01 % ;③小米95 %，葡萄糖3. 49 %，酵 母膏1.2%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸镁0.2%，另加维生素 B10. 01% ;④高粱米45%，玉米 渣40%，小米10%，蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉0.8%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸镁0. 1% ; ⑤大米...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋显和，田野，
申请(专利权)人：宋显和，田野，
类型：发明
国别省市：吉林;22