猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征的二联疫苗及其制备方法。该二联疫苗为冻干疫苗，其中含有猪圆环病毒2型SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒R98株活病毒，同时疫苗稀释液中加入了佐剂，可进一步提高疫苗的免疫效果。本发明专利技术提供的二联冻干疫苗抗原之间无免疫干扰作用，该疫苗成品质量检验均可达到各自单苗的质量标准；在免疫保护效果上，其效果优于单苗；该二联冻干疫苗可以简化免疫程序，降低免疫成本，减少免疫猪的应激反应，因此具有较大的市场应用价值。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备 方法
本专利技术属于兽用生物制品
，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒 病二联疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)， 又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病，是目前我国规模化猪场 的主要传染病。猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2)可造成猪免疫抑制，导 致机体抵抗力下降，从而诱发多种病毒和/或细菌的混合感染和继发感染。这两种疾病对 养猪业危害十分严重，给养猪业造成了巨大经济损失，疫苗接种免疫仍是我国防治猪繁殖 与呼吸综合征和猪圆环病毒2型的主要方法。目前猪用疫苗品种较多，多疫苗、多针次免疫 一方面费时费力，另一方面会增加猪体的应激反应，影响免疫效果。 目前市场上已有猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病毒病相应的单苗，需要多次分别 注射，接种动物产生的应激反应强，使用不方便，而多联疫苗虽然使用比较方便，但疫苗各 免疫抗原成分之间往往会产生干扰作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒感染猪体 均能产生免疫抑制作用，因此在制备猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒二联疫苗 时，应保证两者不产生免疫干扰现象，即不降低各自的免疫效果。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种含有猪繁殖与呼吸综合征活病毒、猪圆环病毒2型 灭活病毒的二联疫苗，可以同时防控蓝耳病、猪圆环病毒病。经动物试验证明，该二联疫苗 的两种抗原之间不会产生免疫干扰作用，二联疫苗中猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病 毒2型产生的免疫效果优于单苗，因此该二联疫苗具有较大的应用价值。 为了实现上述指标，本专利技术采取了如下技术方案： 1. -种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，该疫苗为冻干疫苗，含有 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2)SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征 病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)R98 株活病毒。 2.本专利技术所涉及的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方 法，包括以下步骤： (1)猪圆环病毒2型抗原的制备 1)将检验合格的猪圆环病毒2型（SH株）种毒按（V/V) 2%?10%接种至生长成 良好单层的PK15-B1细胞瓶中，加入细胞维持液，置37°C下培养。培养4日后收获，置-20°C 下冻融3次，收获细胞培养物； 2)对猪圆环病毒2型抗原进行超滤浓缩后使其病毒含量为106 5?107 5TCID5Q/ ml ； 3)猪圆环病毒2型抗原中加入终体积比为0.05%?0.5%的β-丙内酯，混合均 匀，4°C灭活24?36小时，37°C降解2?4小时； (2)猪繁殖与呼吸综合征抗原的制备 用转瓶培养Marcl45细胞，待长成良好单层后，倒去细胞液，将猪繁殖与呼吸综合 征病毒R98株种毒原液按（V/V)2%?10%比例接种于细胞上，轻轻旋转细胞瓶，37°C吸附 10分钟，加上细胞维持液，置37°C旋转培养，当病变细胞达75%以上时收获细胞和细胞液， 收获后的猪繁殖与呼吸综合征病毒液病毒含量为1〇 6 5?l〇7 5TCID5(l/ml ; (3)配苗将上述灭活后的猪圆环病毒2型（SH株）抗原与猪繁殖与呼吸综合征活 病毒（R98株）抗原等量混合，在抗原混合液中加入终体积比为30%?60%的常规冻干保 护剂，混匀、定量分装、冻干； (4)疫苗稀释液的配制在口册.8?7.2?85中加入10%?20%的]?〇1^311丨(16 1661 佐剂（W/V)，利用低剪切力的磁力搅拌器乳化30?60分钟，制备疫苗稀释液。 本专利技术详细实施方式 一、疫苗制备 1.猪圆环病毒2型抗原液的制备与检验 (1)接毒将检验合格的PCV2SH株种毒按（V/V)3%接种至生长成良好单层的 PK15-B1细胞瓶中，加入细胞维持液，置37°C下培养。培养4日后收获，置-20°C下冻融3次， 收获细胞培养物，取少量样品进行无菌检验及病毒含量的测定。收获后病毒液置于_20°C保 存。 (2)无菌检验按《中国兽药典》（中国兽药典委员会，《中华人民共和国兽药典2010 年版》三部，中国农业出版社，2011年，本专利技术以下称《中国兽药典》）附录进行检验，抗原液 无菌生长。 (3)病毒含量测定将PCV2SH株病毒液用含4%犊牛血清的DMEM细胞维持液作10 倍系列稀释，取1(Γ 5、1(Γ6、1(Γ73个稀释度，分别接种PK15-B1细胞单层的96孔细胞培养板， 每个稀释度接种4孔，100 μ 1/孔，同时设立正常细胞对照，置37°C含5% C02的培养箱中继 续培养24小时，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24 小时后进行间接免疫荧光试验，具体方法如下： 1)病毒稀释与接种将PCV2病毒液用含4%犊牛血清的DMEM细胞维持液作10倍 系列稀释，取10'10'1(Γ 73个稀释度，分别接种PK15-B1细胞单层的96孔细胞培养板，每 个稀释度接种4孔，100 μ 1/孔，同时设立正常细胞对照，置37°C含5% C02的培养箱中继续 培养24小时，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的DMEM细胞维持液换液，继续培养24小 时。 2)细胞固定弃去营养液，用PBS(0. Olmol/L，pH值7. 0)洗涤细胞3次；加入冷丙 酮（80%丙酮，20%双蒸水），150 μ 1/孔，置2?8°C下作用30分钟。 3)加入PCV2抗体弃去丙酮，置室温下干燥，用PBS洗涤1次，加入1 : 20稀释的 PCV2抗体，50 μ 1/孔，置37°C下作用1小时。 4)加入FITC标记的SPA弃去孔内液体，用PBS洗涤5次，加入1 : 100稀释的 FITC标记的SPA，50y 1/孔，置37°C下作用1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤5次。 5)镜检观察将上述细胞培养板置荧光显微镜下观察。正常细胞对照孔应无荧光物 质着染；有绿色荧光物质着染的细胞孔，判为PCV2感染阳性。 6)计算TCID5(I统计每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性的孔数，根据Karber 法计算病毒TCID5Q。 (4)浓缩根据病毒含量测定的结果，对PCV2抗原进行适当倍数的超滤浓缩，对 浓缩后抗原进行无菌检验、病毒含量的测定。经检验，该抗原液无菌生长，病毒含量为 10 7 0TCID50/ml。 (5)灭活将检验合格的病毒液中加入终体积为0. 2%的β -丙内酯，4°C灭活24小 时，37°C降解4小时获得灭活抗原。取少量灭活后病毒液进行无菌检验及灭活检验。 (6)灭活检验取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，置37°C下吸附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，其特征在于该疫苗为冻干疫苗，含有猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus，PRRSV)R98株活病毒。

【技术特征摘要】
1. 一种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗，其特征在于该疫苗为冻干疫 苗，含有猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2)SH株灭活病毒和猪繁殖与呼吸 综合征病毒（Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus，PRRSV)R98 株活病毒。2. -种猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征二联疫苗及其制备方法，该方法包括以 下步骤： (1) 猪圆环病毒2型抗原的制备 将猪圆环病毒2型SH株种毒按（V/V)2%?10%接种至生长成良好单层的PK15-B1细 胞瓶中，加入细胞维持液，置37°C下培养。培养4日后收获，经冻融收获细胞培养物； 对猪圆环病毒2型抗原进行超滤浓缩，使其病毒含量为106 5?107 5TCID5(l/ml ; 将检验后的猪圆环病毒2型抗原中加入终体积比为0. 05%?0. 5%的β-丙内酯，混 合均匀，...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪芬芳，何叶峰，孙石静，何海蓉，董彦鹏，刘怡，胡静雅，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32