测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法技术

本发明专利技术涉及科研试验技术领域，具体涉及一种测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法，采用一种自配试剂测定粪便类固醇代谢物的含量，所述的测定及分析步骤依次为：1)试剂的配制；2)微孔板包被蛋白质A；3)储存溶液的制备；4)工作液的配制；5)分析步骤；6)吸光率测定和计算。采用自配试剂测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法，主要基于实验室内自配试剂进行操作，节省费用。而且能够很准确地测定类固醇代谢物含量。本发明专利技术给出了绵羊的粪便排泄物中类固醇代谢物含量的测定方法，非组织损伤采样，避免了采血对类固醇激素含量的影响，避免了对畜体的伤害。

【技术实现步骤摘要】
测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法
本专利技术涉及科研试验领域，具体涉及测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法。
技术介绍
目前粪便排泄物中类固醇代谢物含量的测定研究主要集中于野生动物及珍稀鸟类等，在家养动物中研究极少。而野生动物和珍稀鸟类的粪便排泄物采集需要采血或者组织损伤采样，这样会对畜体造成伤害。目前粪便中类固醇代谢物的测定主要应用于试剂盒，费用高昂，耗费时间。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述技术问题中存在的缺点，提供了一种测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法，该方法主要基于实验室内自配试剂进行操作，节省费用。解决上述技术问题的技术方案为：测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法，采用一种自配试剂测定粪便类固醇代谢物的含量，所述的测定及分析步骤依次为：1)试剂的配制；2)微孔板包被蛋白质A；3)储存溶液的制备；4)工作液的配制；5)分析步骤；6)吸光率测定和计算。进一步地说，所述的自配试剂的配制步骤具有以下九个方面：1)第一包被液的配制，采用Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，双蒸水溶解，pH调至9.6；2)配制1mol/L的HCL；3)缓冲液的配制，2.42g三羟氨基甲烷，20mmol/L；17.9gNaCl，0.3mol/L；1g牛血清白蛋白；1ml吐温80；pH调至7.5；4)第二包被液的制备，量取3.146g三羟氨基甲烷；23.3gNaCl；13gBSA；1.3g叠氮化钠，用双蒸水溶解，并配成1.3L，pH调至7.5；5)清洗液的配制，0.5ml的吐温20，加2.5L双蒸水；6)辣根过氧化物酶底物缓冲液的配制，配制10mmol/l的醋酸钠溶液，取该溶液1.36g用双蒸水溶解，并配成1L，用5％的柠檬酸大约8ml将pH调至5.0；7)链霉亲合素反应的酶浓缩溶液的配制，取上述步骤3)所制得的缓冲液30ml与0.001ml链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物在磁力搅拌器上混合均匀；8)辣根过氧化物酶的底物溶液配制，取30ml的底物缓冲液、0.5ml3，3′，5，5′-四甲基苯(0.4％)和0.1ml过氧化氢(0.6％)在磁力搅拌器上温和混匀；9)终止剂的配制，配制2mol/L硫酸，取900ml双蒸水与100ml硫酸(95-97％)混合均匀。进一步地说，所述的微孔板包被蛋白质A的制备步骤为：对一个96孔微孔板，准备50μg的蛋白质A溶液，溶解于25ml的第一包被液中(2μg蛋白质A/ml)，分配稀释的蛋白质A在微孔板上，每孔0.25ml，室温下将微孔板培养过夜，弃掉原溶液，并重新用第二包被液将孔重新注满，每孔0.3ml，用封口膜和防尘罩将已注满的微孔板盖上，室温保存直至使用，可以在3小时之后使用。室温下保存微孔板不要超过4周。(将板干燥，-20度冷冻，可以使微孔板保存时间更长)进一步地说，所述的储存溶液的制备方法为：用20ml缓冲液稀释0.01ml的储存溶液(1mg类固醇：1ml甲醇)，超声浴混匀2分钟，静置3个小时，按每瓶0.05ml分装到新小瓶中，每个小瓶含有相应类固醇25000pg。所有储存溶液-20度低温保存直至使用。防水颜色标签贴于小瓶上以表示不同成分：例如：蓝色：抗体(AB)；红色：生物素标记类固醇(BL)；绿色：标准液。进一步地，所述的工作液的制备方法为：按每瓶0.15ml缓冲液分配于部份标准小瓶，震荡并静置20分钟，以1∶2.5的比例稀释该溶液7次，在每个步骤均要充分混合(500pg/0.01ml-2pg/0.01ml)。可用HamiltonMicrolabdispenser1000(0.09ml标准液+0.135ml缓冲液)来完成，或者可用0.15ml缓冲液混合整个标准小瓶(0.05ml)，并再加入2.3ml缓冲液(必须将液体转移到更大的小瓶中)。此结果浓度为500pg/50μl缓冲液，然后再进一步稀释(1∶2.5；1ml+1.5ml缓冲液)，在一些非常敏感的分析中，进行9次稀释，并弃掉前两次稀释溶液(80pg/0.01ml-0.3pg/0.01ml)。标准液、抗体和生物素标记溶液在使用之前必须温育20分钟。抗体和生物素标记类固醇：对每个单独的EIA，去看特定标签。进一步地，所述的分析步骤包括以下十个方面：1)提取粪便，再对提取物预处理；粪便采集后立即将样本冷冻，在-20度下进行贮存，直到分析。称取0.5g湿的排泄物加5ml80％的甲醇(预先配制，或用4ml100％的甲醇和1ml的水混匀)，在多管式涡流搅拌器中30min(或者在手动涡流搅拌器中1-2min，然后离心机中15min，2500g)；2)清洗微孔板；使用之前，用清洗液清洗包衣微孔板三次，用吸水纸吸走剩下的液体，干燥微孔板。注意不要触碰微孔板的底部。3)标准液和样本移液；在微孔板上，每个空白孔加入0.05ml缓冲液；每个标准液孔加入事先配好的标准液50μl；每个样品孔加入0.01ml样品、0.04ml缓冲液，每孔共0.05ml；每孔均为0.05ml，可用HamiltonMircolabdispenser1000来进行分配。4)生物素标记类固醇(BL)的分配；每孔加入0.1ml生物素标记类固醇。所有移液步骤，都要用multi-pipette(多管移液器)。5)抗体(AB)的分配；每孔加入0.1ml抗体溶液。(注意：空白孔用缓冲液代替AB)用封口膜和防尘盖盖上微孔板，在4度下轻晃温育过夜。6)温育后清洗微孔板；弃掉温育后微孔板内液体，用冷(4度)清洗液清洗微孔板4次。7)链霉亲和素反应；每孔加入0.25ml酶溶液，将封口覆盖的微孔板置于摇床上4度温育45分钟。8)再次清洗微孔板；步骤同上述步骤6)；9)显色反应；每孔加入0.25ml底物溶液，，将封口覆盖的微孔板4度温育45分钟(并搅拌)。10)终止反应；每孔加入0.05ml终止剂(蓝色变为黄色)。更进一步地说，所述的吸光率测定和计算的方法为：用一个自动微孔板连着一台电脑，配备特殊的计算软件，在透光率波长为450nm的条件下进行测定，并计算。采用了上述方案，采用自配试剂测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法，主要基于实验室内自配试剂进行操作，节省费用。而且能够很准确地测定类固醇代谢物含量。本专利技术给出了绵羊的粪便排泄物中类固醇代谢物含量的测定方法，非组织损伤采样，避免了采血对类固醇激素含量的影响，避免了对畜体的伤害。附图说明图1为输入标准品浓度值和吸光滤值图2为回归曲线图3为回归方程图4为输入样品Y值图5为计算出样品浓度值具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。1、试剂配制1.1第一包被液：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，双蒸水溶解，pH调至9.6；1.21mol/LHCl；1.3缓冲液：2.42g三羟氨基甲烷，20mmol/L；17.9gNaCl，0.3mol/L；1g牛血清白蛋白；1ml吐温80；pH调至7.5；1.4第二包被液：3.146g三羟氨基甲烷；23.3gNaCl；13gBSA；1.3g叠氮化钠，用双蒸水溶解，并配成1.3L，pH调至7.5。1.5清洗液：0.5ml的吐温20，加2.5L双蒸水。1.6辣根过氧化物酶底物缓冲液：1.36g醋酸钠＝10mmol/l，用双蒸水溶解，并配成本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法，其特征在于，采用一种自配试剂测定粪便类固醇代谢物的含量，所述的测定及分析步骤依次为：(1)试剂的配制；所述的自配试剂的配制步骤具有以下九个方面：1)第一包被液的配制，采用Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，双蒸水溶解，pH调至9.6；2)配制1mol/L的HCL；3)缓冲液的配制，2.42g三羟氨基甲烷，20mmol/L；17.9g NaCl，0.3mol/L；1g牛血清白蛋白；1ml吐温80；pH调至7.5；4)第二包被液的制备，量取3.146g三羟氨基甲烷；23.3g NaCl；13g BSA；1.3g叠氮化钠，用双蒸水溶解，并配成1.3L，pH调至7.5；5)清洗液的配制，0.5ml的吐温20，加2.5L双蒸水；6)辣根过氧化物酶底物缓冲液的配制，配制10mmol/1的醋酸钠溶液，取该溶液1.36g用双蒸水溶解，并配成1L，用5％的柠檬酸大约8ml将pH调至5.0；7)链霉亲合素反应的酶浓缩溶液的配制，取上述步骤3)所制得的缓冲液30ml与0.001ml链霉抗生物素蛋白‑辣根过氧化物酶结合物在磁力搅拌器上混合均匀；8)辣根过氧化物酶的底物溶液配制，取30ml的底物缓冲液、0.5ml3，3′，5，5′‑四甲基苯(0.4％)和0.1ml过氧化氢(0.6％)在磁力搅拌器上温和混匀；9)终止剂的配制，配制2mol/L硫酸，取900ml双蒸水与100ml硫酸(95‑97％)混合均匀；(2)微孔板包被蛋白质A；所述的微孔板包被蛋白质A的制备步骤为：对一个96孔微孔板，准备50μg的蛋白质A溶液，溶解于25ml的第一包被液中(2μg蛋白质A/ml)，分配稀释的蛋白质A在微孔板上，每孔0.25ml，室温下将微孔板培养过夜，弃掉原溶液，并重新用第二包被液将孔重新注满，每孔0.3ml，用封口膜和防尘罩将已注满的微孔板盖上，室温保存直至使用；(3)储存溶液的制备；所述的储存溶液的制备方法为：用20ml缓冲液稀释0.01ml的储存溶液(1mg类固醇：1ml甲醇)，超声浴混匀2分钟，静置3个小时，按每瓶0.05ml分装到新小瓶中，每个小瓶含有相应类固醇25000pg。(4)工作液的配制；所述工作液的制备方法为：按每瓶0.15ml缓冲液分配于部份标准小瓶，震荡并静置20分钟，以1∶2.5的比例稀释该溶液7次，在每个步骤均要充分混合(500pg/0.01ml‑2pg/0.01ml)。(5)分析步骤；所述的分析步骤包括以下：1)提取粪便，再对提取物预处理；2)清洗微孔板；3)标准液和样本移液；4)生物素标记类固醇(BL)的分配；5)抗体(AB)的分配；6)温育后清洗微孔板；7)链霉亲和素反应；8)再次清洗微孔板；9)显色反应；10)终止反应；终止反应后得到：各孔溶液颜色为程度不一的黄色的微孔板，后放入酶标仪内设定好波长、空白孔位置，测定微孔板各孔的吸光度值；(6)吸光率测定和计算。所述的吸光率测定和计算的方法为：用一个自动微孔板连着一台电脑，配备ELISA Calc回归/拟合计算程序‑v0.1，进行测定，并计算。...

【技术特征摘要】
1.测定绵羊粪便排泄物中类固醇代谢物含量的方法，其特征在于，采用一种自配试剂测定粪便类固醇代谢物的含量，步骤依次为：(1)试剂的配制；所述的自配试剂的配制步骤具有以下九个方面：1)第一包被液的配制，采用Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，双蒸水溶解，pH调至9.6；2)配制1mol/L的HCl；3)缓冲液的配制，2.42g三羟氨基甲烷，20mmol/L；17.9gNaCl，0.3mol/L；1g牛血清白蛋白；1ml吐温80；pH调至7.5；4)第二包被液的制备，量取3.146g三羟氨基甲烷；23.3gNaCl；13gBSA；1.3g叠氮化钠，用双蒸水溶解，并配成1.3L，pH调至7.5；5)清洗液的配制，0.5ml的吐温20，加2.5L双蒸水；6)辣根过氧化物酶底物缓冲液的配制，配制10mmol/l的醋酸钠溶液，取该溶液1.36g用双蒸水溶解，并配成1L，用5％的柠檬酸8ml将pH调至5.0；7)链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶浓缩溶液的配制，取上述步骤3)所制得的缓冲液30ml与0.001ml链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物在磁力搅拌器上混合均匀；8)辣根过氧化物酶的底物溶液配制，取30ml的辣根过氧化物酶底物缓冲液、0.5ml3，3′，5，5′-四甲基苯0.4％和0.1ml的0.6％过氧化氢在磁力搅拌器上温和混匀；9)终止剂的配制，配制2mol/L硫酸，取900ml双蒸水与100ml的95-97％硫酸混合均匀；(2)微孔板包被蛋白质A；所述的微孔板包被蛋白质A的制备步骤为：对一个96孔微孔板，准备50μg的蛋白质A溶液，溶解于25ml的第一包被液中，2μg蛋白质A/ml，分配稀释的蛋白质A在微孔板上，每孔0.25ml，室温...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕慎金，杨燕，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37