禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于动物传染病检测领域，具体涉及禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒及应用。该试剂盒由试纸条、测试卡壳和样品稀释液组成，所述的试纸条由样品垫、吸收垫、涂覆有抗禽流感病毒单抗－胶体金标记物、抗新城疫病毒单抗－胶体金标记物和抗鸡传染性支气管炎病毒单抗－胶体金标记物混合物的结合垫，包被有抗禽流感单抗、抗新城疫单抗，鸡传染性支气管炎单抗的检测线T1，T2、T3，包被有兔抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜，依次按吸收垫、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫的顺序粘贴在不吸水的支撑薄片上构成试纸条。可同时完成禽流感H5型、H9亚型、新城疫病及鸡传染性支气管炎的病原检测，该试剂盒特异性强，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒及应用
本专利技术属于动物免疫应用
。具体涉及禽三种呼吸道疾病(禽流感H5亚型和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎)病原检测的三联快速检测试剂盒及及应用。本专利技术制备的试剂盒壳一次同时完成对禽三种呼吸道疾病如禽流感H5亚型和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎病原的快速检测。
技术介绍
禽的呼吸道感染在养禽生产实践中是一类极为常见的疾病，尤其是该类疾病的发生复杂多变，给养禽业带来了巨大的经济损失。引发禽的呼吸道感染的病原主要包括病毒、细菌及支原体，其中均由RNA病毒引起的三种疾病禽流感(Avian influenza，Al)、新城疫(Newcastle disease, ND)及鸡传染性支气管炎(Infectious laryngotrache, IB)是在养鸡场中较为常见。三种疾病在临床上有相似的呼吸道症状，加之临床表现多为非典型性，疾病感染多为混合性，仅据临床症状和病理表现难以确诊，因此如何快速准确地做出诊断是有效预防治疗疾病，避免造成严重经济损失之根本。目前，对禽流感、新城疫及鸡传染性支气管炎确诊的方法主要为分子生物学诊断法和血清学诊断法。分子生物学诊断技术主要有RT-PCR，核酸探针技术，限制性酶切片段长度多态性分析等。血清学诊断主要有琼脂扩散试验(AGID)，血凝试验和血凝抑制试验(HA/HI)，免疫荧光法，酶联免疫法(ELISA)和免疫层析法等。分子生物学诊断法具有特异性强、灵敏度高等特点，但是对实验设备、实验人员具有较高的要求。血清学诊断法中琼脂扩散试验，血凝试验和血凝抑制试验操作较为简单，但其特异性和灵敏度不高，其他如免疫荧光，酶联免疫法同样对设备，人员及操作有高要求。上述方法大多耗时较长(如RT-PCR需1.5?2小时；琼脂扩散试验需24?48小时；血凝抑制试验需2?3小时；ELISA试验需3?5小时等)，不便于适时和快速诊断，所以均无法在基层大范围地推广使用。胶体金免疫层析(gold-1mmunochromatography assay GI CA)是以胶体金作为示踪物，基于胶体金标记技术应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。其核心技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，因毛细管作用而促使样品溶液在层析条上泳动，并使样品中的待检物与层析膜上针对待检物的受体(如抗原或抗体)在短时间内发生高特异性、高亲和性的免疫反应。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。基于该技术，国内外在人医疾病监测，环境危害监控，食品安全保障及畜禽疾病检测等领域，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测测试卡。在鸡疫病诊断和检测方面，鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊及鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒获得相关专利(专利号:200710169103.0 ；200710169105.X ；200710169104.5 ；200710169106.4)。但是上述试剂盒是对相关疾病或疫苗免疫后抗体水平的检测，而不能准确的反应鸡群是否感染疫病。虽然目前也有部分针对单个病原的免疫胶体金检测方法，如专利申请号为200510042631.0的“禽流感病毒抗原检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法”，专利申请号为200510057023.7的文献“禽流感免疫胶体金诊断试纸条和测试卡”公开了几种检测禽流感病毒抗原的制备方法，但是对于混合感染的病例的诊断效果并不佳，使用多个单检胶体金试纸条进行检测又造成了时间和资源的浪费。而多元检测可以一次性的针对多个病原进行检测，从而很好的解决了这个问题。三元的联合检测试剂盒(测试卡)可使所耗降低至三分之一，从而为社会节省出大量资源，为疾病有效的快速治疗提供了更为充足的时间。本专利技术通过分别制备禽流感、新城疫及鸡传染性支气管炎单克隆抗体各两株，利用双抗夹心免疫层析技术，用单个测试卡同步即可检测样品中是否为禽流感、新城疫及鸡传染性支气管炎病原。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有检测技术的缺陷，提供一种适用于禽三种呼吸道疾病(禽流感H5亚型和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎)病原检测的三联快速检测试剂盒及应用，本专利技术的试剂盒特异性强、灵敏度高、操作简便，可用于同步完成禽流感H5和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎病毒三种禽呼吸道疾病病原的检测。本专利技术还涉及六株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的构建与开发利用。本专利技术的总体技术路线图如图1所示。本专利技术通过以下技术方案实现:为了实现本专利技术， 申请人:分别制备了两种针对不同抗原位点且能分抗禽流感病毒(简称AIV)杂交瘤细胞株XYCSJL-AIV-2B8及XYCSJL-AIV-4B7，两种分泌抗新城疫病毒(简称NDV)杂交瘤细胞株XY⑶Y-NDV-3E11及XY⑶Y-NDV-4B10和两种分泌抗鸡传染性支气管炎病毒(简称IBV)杂交瘤细胞株XYCDY-1BV-3G5及XYCDY-1BV-1E6。上述六株细胞均已于2014年3月11日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，对应的保藏信息汇总于如表1。表1本专利技术制备的六株杂交瘤细胞株的保藏信息本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测禽流感病毒H5亚型和H9亚型、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的抗原的三联试剂盒，它包含盒体、设在盒体内的测试卡和样品稀释液；其特征在于：所述的测试卡由试纸条与测试卡壳组成；试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴在PVC背衬上构成；所述的金标垫上包被有抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL‑AIV‑2B8－胶体金标记物，抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY‑NDV‑3E11－胶体金标记物和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY‑1BV‑3G5－胶体金标记物的混合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL‑AIV‑4B7、抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY‑NDV‑4B10和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY‑1BV‑1E6构成的检测线T1，T2、T3和兔抗鼠IgG构成的质控线； 其中： 金标垫上包被为抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL‑AIV‑2B8－胶体金标记物，抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY‑NDV‑3E11－胶体金标记物和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY‑1BV‑3G5－胶体金标记物的混合物，其中三种单克隆抗体分别由抗禽流感病毒杂交瘤细胞株XYCSJL‑AIV‑2B8、抗新城疫病毒杂交瘤细胞株XYCDY‑NDV‑3E11和抗鸡传染性支气管炎病毒杂交瘤细胞株XYCDY‑1BV‑3G5所分泌，这些杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号依次为CCTCC NO：C201449；CCTCC NO：C201451和CCTCC NO：C201450； 所述硝酸纤维素膜上包被为抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL‑AIV‑4B7、抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY‑NDV‑4B10、抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY‑1BV‑1E6构成检测线T1，T2、T3的三种单克隆抗体分别由抗禽流感病毒杂交瘤细胞株XYCSJL‑AIV‑4B7、抗新城疫病毒杂交瘤细胞株XYCDY‑NDV‑4B10和抗鸡传染性支气管炎病毒杂交瘤细胞株XYCDY‑1BV‑1E6所分泌，这些杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号依次为CCTCC NO：C201453；CCTCC NO：C201455和CCTCC NO：C201454。...

【技术特征摘要】
1.检测禽流感病毒H5亚型和H9亚型、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的抗原的三联试剂盒，它包含盒体、设在盒体内的测试卡和样品稀释液；其特征在于:所述的测试卡由试纸条与测试卡壳组成；试纸条由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴在PVC背衬上构成；所述的金标垫上包被有抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL-AIV-2B8 —胶体金标记物，抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY-NDV-3E11 —胶体金标记物和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY-1BV-3G5 —胶体金标记物的混合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL-AIV-4B7、抗新城疫病毒单克隆抗体XY⑶Y-NDV-4B10和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XY⑶Y-1BV-1E6构成的检测线Tl，T2、T3和兔抗鼠IgG构成的质控线； 其中: 金标垫上包被为抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL-AIV-2B8 —胶体金标记物，抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY-NDV-3E11 —胶体金标记物和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XY⑶Y-1BV-3G5 —胶体金标记物的混合物，其中三种单克隆抗体分别由抗禽流感病毒杂交瘤细胞株XYCSJL-AIV-2B8、抗新城疫病毒杂交瘤细胞株XY⑶Y-NDV-3E11和抗鸡传染性支气管炎病毒杂交瘤细胞株XYCDY-1BV-3G5所分泌，这些杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号依次为CCTCC NO:C201449 ；CCTCC NO:C201451和CCTCC NO:C201450 ； 所述硝酸纤维素膜上包被为抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL-AIV-4B7、抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY-NDV-4B10、抗鸡 传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY-1BV-1E6构成检测线Tl，T2、T3的三种单克隆抗体分别由抗禽流感病毒杂交瘤细胞株XYCSJL-AIV-4B7、抗新城疫病毒杂交瘤细胞株XYCDY-NDV-4B10和抗鸡传染性支气管炎病毒杂交瘤细胞株XYCDY-1BV-1E6所分泌，这些杂交瘤细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖运才，王喜亮，石德时，刘锡玲，苏金玲，都跃，毕丁仁，周祖涛，李自力，刘梅，
申请(专利权)人：华中农业大学，武汉华大瑞尔科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42