一种微生物发酵产苯丙氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效、安全的微生物发酵生产L-苯丙氨酸方法，属于生物工程技术领域。通过硫酸铵浓度和有机氮源种类优化，以及多阶段L-酪氨酸指数补料方法，显著提高发酵液中L-苯丙氨酸的浓度。L-苯丙氨酸产量达到56g/L左右。同时，硫酸铵、酵母粉和L-酪氨酸用量较普通发酵方法相比明显减少，大大降低了L-苯丙氨酸的生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物发酵产苯丙氨酸的方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种发酵制备L-苯丙氨酸的新方法，具体是对发酵生产L-苯丙氨酸的过程，进行了氮源的优化以及多阶段指数L-酪氨酸补料策略的提出。
技术介绍
L-苯丙氨酸，又称L-苯基丙氨酸，是人体必需的但无法自行合成的八种必需氨基酸之一，广泛应用于医疗药品、化妆品、食品及其添加剂领域，特别的，作为合成甜味剂阿斯巴甜的原料之一。L-苯丙氨酸的传统生产方法是化学合成法和酶法，但是化学合成法具有环境污染、产物大多是消旋体，后续加工工艺复杂；酶法具有原料昂贵等缺点。考虑到环境和生产成本问题，最经济的同样也是被人们广泛使用的是微生物发酵法。L-苯丙氨酸的生产菌株，大多数是L-酪氨酸营养缺陷型的。发酵过程中过量添加L-酪氨酸，则会造成细胞的大量生长，从而使得更少的碳流流向L-苯丙氨酸的合成；添加的L-酪氨酸过少，则会引起细胞生长缓慢甚至过少，从而没有足够的菌体产生更多的L-苯丙氨酸。目前，L-酪氨酸补料有进行恒定速度流加，有根据L-酪氨酸消耗速率流加，有根据发酵过程的OUR的相关公式流加，也有L-酪氨酸指数补料的。中国专利CN102212569A公开了一种提高L-苯丙氨酸生产强度的L-酪氨酸流加的方法。在初始培养基中L-酪氨酸消耗完毕后，其以25mg/h-100mg/h恒速流加至发酵结束。由此，本专利技术提出了多阶段指数流加L-酪氨酸的策略，从而达到提高L-苯丙氨酸，降低生物制备L-苯丙氨酸的生产成本，提高经济效益的目的。另外，发酵过程的氮源，不仅维持细胞的正常生长，而且在产L-苯丙氨酸的过程中起着重要的作用。由此，微生物发酵产L-苯丙氨酸过程中，进行氮源的优化，包括硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，以达到产量提高，以及原料的减少。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种生产L-苯丙氨酸的发酵方法，包括菌种活化、种子培养、发酵培养，其特征在于，还包括多阶段指数L-酪氨酸补料策略。进一步的，所述的方法还包括发酵培养基中氮源的优化。进一步的，所述的发酵的菌株为大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)。进一步的，所述的多阶段指数L-酪氨酸补料策略具体步骤如下：发酵12h后开始补加L-酪氨酸；12-32h维持菌体比生长速率在0.08h-1；32-52h，维持菌体比生长速率为0.05h-1；52-72h,维持菌体比生长速率为0.02h-1。进一步的，初始L-酪氨酸浓度为0-2.4g/L，优选的为0.3-1g/L。进一步的，所述的氮源优化包括对发酵培养基中硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化。进一步的，所述的硫酸铵的浓度为0-30g/L，优选的在5g/L以下。进一步的，所述的有机氮氮源的优化为单一有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉10g/L、玉米浆干粉11.5g/L、棉籽饼粉10g/L、豆饼浸粉7.9g/L、蛋白胨9.2g/L。进一步的，所述的有机氮氮源的优化为复合有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉5g/L和玉米浆干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米浆干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L，优选的，为酵母粉和玉米浆干粉复合有机氮源。进一步的，所述有机氮源的总氮量是相当，并且复合有机氮源中两个单一有机氮源是按其含氮量1:1添加本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过对氮源的优化设计，减少硫酸铵用量和利用一些廉价的有机氮源替代一些昂贵的有机氮源，同时通过多阶段指数L-酪氨酸补料策略的提出减少了L-酪氨酸的流加量，从而达到提高L-苯丙氨酸产量，降低生物制备L-苯丙氨酸的生产成本，提高经济效益，有利于L-苯丙氨酸生物法的工业制备。附图说明图1为不同浓度的硫酸铵条件下大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)发酵制备L-苯丙氨酸的趋势图图2为不同种类的有机氮源条件下大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)发酵制备L-苯丙氨酸的趋势图(注：YE酵母粉，CSP玉米浆干粉，CP棉籽饼粉，SP豆饼浸粉，T蛋白胨，CSPYE酵母粉和玉米浆干粉，CSPT蛋白胨和玉米浆干粉，YET酵母粉和蛋白胨)。图3为不同初始酪氨酸条件下，大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)的不同比生长速率对应的比合成L-苯丙氨酸的合成速率的趋势图图4(a)和(b)为大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)采用多阶段指数L-酪氨酸补料策略，(a)是不同L-酪氨酸流加速率、设定的比生长速率和真实的比生长速率的时间趋势，(b)细胞干重、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸浓度的时间趋势。注：Ftyr为酪氨酸流加速度，μ为比生长速率，μset为设定的比生长速率具体实施方式下面的实施例对本专利技术作详细说明，但对本专利技术没有限制。本实施例采用菌株为大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)，(宫长斌等，过程工程学报，2007年第7卷第3期，254-258)。该出发菌株系申请人拥有的在先公开文献公开的菌株，由申请人自行保藏，申请人在此声明从本专利申请日起免费发送该出发菌株。实施例1本实施例说明利用大肠杆菌BL21产L-苯丙氨酸的方法,由本实验室保存。(大肠杆菌BL21购自北京全式金生物技术有限公司)具体包括以下步骤：(1)菌种活化：斜面培养时，菌株在斜面培养基中进行平板划线后，在恒温培养箱中培养，温度30-40℃，活化培养时间1-2d,用于种子培养基接种和菌株保存；(2)种子培养：向500mL三角瓶中加入种子培养基50mL,高压蒸汽121℃灭菌20min,冷却后接入斜面培养基菌株，培养温度30-40℃，摇床转速培养时间1-2d；(3)发酵培养：1L发酵罐中发酵培养基体积0.5-0.8L,接种量5％-10％(v/v)，温度30-40℃，搅拌速度200-500rpm,通气量是0.5-0.8vvm。发酵过程中通过添加氨水和2mol/L盐酸控制pH在7.0左右，发酵时间72h。所述斜面培养基/种子培养基配方为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl5g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L；所述发酵培养基配方为葡萄糖25g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO43g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、L-Tyr0.3g/L、酵母粉10g/L、维生素B10.075g/L、TES1.5mL/L；其中TES组成为:Al2(SO4)3·18H2O2g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O0.25g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·7H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L；当葡萄糖耗完后，补加700g/L的葡萄糖，并控制葡萄糖浓度在5g/L左右；当发酵12-18h后，以0.06g/h的速度进行L-酪氨酸补料，产L-苯丙氨酸含量在2.8g/L左右。实施例2本实施例说明大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)制备L-苯丙氨酸的优化方法，主要涉及硫酸铵浓度的优化本实施例采用菌株为大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)，发酵培养基中的硫酸铵浓度(g/L)分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产L‑苯丙氨酸的发酵方法，包括菌种活化、种子培养、发酵培养，其特征在于，还包括多阶段指数L‑酪氨酸补料策略。

【技术特征摘要】
1.一种生产L-苯丙氨酸的发酵方法，包括菌种活化、种子培养、发酵培养，其特征在于，还包括多阶段指数L-酪氨酸补料策略；还包括发酵培养基中氮源的优化；所述的多阶段指数L-酪氨酸补料策略具体步骤如下：发酵12h后开始补加L-酪氨酸；12-32h维持菌体比生长速率在0.08h-1；32-52h，维持菌体比生长速率为0.05h-1；52-72h，维持菌体比生长速率为0.02h-1；所述的氮源优化包括对发酵培养基中硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化；所述的硫酸铵的浓度在5g/L以下；所述的有机氮源的优化为单一有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉10g/L、玉米浆干粉11.5g/L、棉籽饼粉10g/L、豆饼浸粉7.9g/L、蛋白胨9.2g/L或者所述的有机氮...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，袁佩佩，何珣，曹伟佳，王震，肖文，赵艳，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32