确定芸苔中FAD3基因的接合性的方法技术

本公开内容部分涉及用于芸苔中fad-3c基因的检测和高通量接合性分析的端点PCR测定法。本公开内容部分涉及野生型DNA作为参照在确定接合性中使用的用途。这些和其它相关规程可以用于独特鉴定包含题述基因的芸苔系的接合性和品种。本公开内容还提供了用于例如从芸苔植物或种子的样品确定接合性的相关试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】确定芸苔中FAD3基因的接合性的方法对相关申请的交叉引用本申请要求2011年10月21日提交的美国临时申请N0.61/550，170的优先权，其在此通过提述以其整体并入本文。专利技术背景芸苔(Brassica)属包括芸苔(canola)，即世界上最重要的含油种子作物之一，且温带地理中种植的一种重要含油种子作物。芸苔在传统上表征为欧洲油菜(Brassica napus L.)( 一种由于完青(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)的种间杂交的结果衍生的物种)，其中已经通过常规育种消除或显著降低芥酸和芥子油苷(glucosinolates)。大部分芸苔油为生产用于人消费的植物油形式。在工业应用中使用芸苔油也有一个不断增长的市场。芸苔属由拥有标记为A基因组、B基因组或C基因组的独特基因组的三种二倍体物种构成。芜青植物拥有二倍体A基因组。黑芥(Brassicanigra)植物拥有二倍体B基因组。甘蓝植物拥有二倍体C基因组。这些物种的杂种可以经由两个二倍体物种之间的杂交生成。芸苔是一种双二倍体物种，认为其产生自具有二倍体C基因组的甘蓝和具有二倍体A基因组的芜青的杂交。细胞遗传研究揭示的AA和CC基因组显示关联性程度，其彼此部分同源，并且认为源自共同的祖先基因组(Prakash和Hinata，1980)。虽然在技术上分类为二倍体，这两种祖先物种的基因组含有高百分比的彼此重叠的(duplicative)区域(Song等，1991)。遗传分析揭示了芜青的AA基因组将10条染色体贡献给欧洲油菜，而甘蓝以母本供体贡献来自其CC基因组的9条染色体(Song等，1992)。源自芸苔种子的特定品种的可食用油和工业油的质量由其组成性脂肪酸确定，因为脂肪酸不饱和的类型和量对饮食和工业应用两者都具有牵连。常规的芸苔油含有约60%油酸(C18:l)、20%亚油酸(C18:2)和10%亚麻酸(18:3)。常规芸苔典型的多不饱和亚麻酸的水平是不合意的，因为油容易被氧化，氧化速率受到几个因素影响，包括氧气的存在、暴露于光和热、和天然的或添加的抗氧化剂和促氧化剂在油中存在。氧化引起由于重复油炸(诱导的氧化)或贮存延长的时段(自身氧化)所致的臭气和酸败。氧化还可以改变芸苔油的润滑和粘性性质。相对于常规芸苔油展现出降低的多不饱和脂肪酸水平和升高的单不饱和油酸水平的芸苔油谱(profile)与较高的氧化稳定性有关。个别脂肪酸对氧化的易感性依赖于其不饱和程度。如此，亚麻酸(其拥有三个碳-碳双键)的氧化速率是油酸(其仅具有I个碳-碳双键)的氧化速率的25倍，且是亚油酸(其具有2个碳-碳双键)的氧化速率的2倍。亚油酸和亚麻酸对风味和气味也具有最多的影响，因为它们容易形成氢过氧化物。高油酸油(.Gtoreq.70%油酸)在贮存、油炸和精炼过程中不太易于氧化，并且可以加热至较高的温度而不冒烟，使得其更适合作为烹调油。 芸苔油的质量由其组成性脂肪酸，如油酸(C18:l)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)确定。大多数芸苔栽培变种通常产生具有约55-65%油酸和8-12%亚麻酸的油。高浓度的亚麻酸导致油不稳定性和非正常型(off-type)风味，而高水平的油酸提高油的氧化稳定性和营养价值。因此，开发具有增加的油酸和减少的亚麻酸的芸苔栽培变种对于芸苔油质量是高度期望的。鉴定两个基因座，并且其基因组位置从拥有增加的油酸和减少的亚麻酸数量的芸苔栽培变种定位。一个基因座对增加的油酸和减少的亚麻酸的生成具有主要影响，而第二个基因座具有次要影响。高油酸(C18:l)的主要基因座确定为是脂肪酸去饱和酶-2(fad-2)基因，并且其位于连锁群N5上。第二个基因座位于连锁群NI上。亚麻酸(C18:3)的一个主要数量性状基因座(QTL)是基因组C的脂肪酸去饱和酶-3基因(fad-3c)，并且其位于连锁群N14上。第二个主要QTL驻留于N4连锁群上，并且是基因组A的脂肪酸去饱和酶-3基因(fad-3a)。从甲磺酸乙酯(EMS)诱导的突变体和野生型芸苔栽培变种两者扩增fad-2和fad_3c基因的基因组序列并且测序。fad_2和fad_3c基因的突变体和野生型等位基因序列的比较揭示来自EMS突变植物的基因中的单核苷酸多态性(SNP)。基于突变体和野生型等位基因之间的序列差异，开发出两种SNP标志物，其对应于fad-2 和 fad-3c 基因突变。(Hu 等，2006)。目前用于生成F1杂种芸苔种子的方法就成本和种子纯度而言具有局限。一般地，这些方法需要稳定的、同胞不相容的(sib-1ncompatible)且自身不相容的(self-1ncompatible)、几乎纯合的亲本育种系，该亲本育种系仅在重复自交以生成近交系后可得到。此外，开发和维持亲本系的育种通过劳动密集型技术，如芽传粉实现，因为基于自身不相容性状的芸苔杂种种子生成系统必须利用强烈自身不相容性植物。育种过程期间的环境条件，如温度和湿度通常影响植物脂质代谢，如此还影响脂肪酸的含量水平(Harwood, 1999)。因此,环境可变性使得植物的表型选择不太可靠。Deng和Scarth(1998)发现开花后温度的升高显著降低C18:3的水平并且提高C18:1的水平。在其它研究中报告类似的结果(Yermanos 和 Goodin, 1965 ；Canvin, 1965)。低亚麻酸品种的育种是特别有挑战的，因为C18:3含量是一种多基因性状，并且以隐性方式以相对较低的遗传力遗传。源自Stellar(具有低C18:3含量(3%))和Drakkar(具有〃常规的〃C18:3水平(9-10% ))之间的杂交的群体的遗传分析指示低C18:3性状受到称作LI和L2的具有加和效应(additive effect)的两个主要基因座控制(Jourdren等，1996b)。发现控制C18:3含量的这两个主要基因座对应于两个fad_3 (脂肪酸去饱和酶-3)基因；一个位于A基因组(源自芜青)上，而另一个位于C基因组(源自甘蓝(Brassica olecera))上(Jourdren 等，I6 ；Barret 等，I9)。由于遗传(加和、显性和上位)和环境影响而不断变化的性状通常称为“数量性状”。基于两个因素可将数量性状与“质量”或“离散”性状区别:对基因表达的环境影响，其产生表型的连续分布；和通过多基因遗传力产生的复杂分离方式。与数量性状的表达有关的基因组的一个或多个区域的鉴定导致数量性状基因座(“QTL”)的发现。Thormann等(1996)定位两个QTL，其解释亚麻酸含量的60%变化，而Somers等(1998)鉴定三个QTL，其共同解释C18:3含量的51%表型变化。Chen和Beversdorf (1990)也报告了三基因座加和模型。Rucker和Robbelen (1996)指示几个次要基因最可能牵涉去饱和步骤。C18:3含量的遗传力估计为26-59% (Kondra和Thomas, 1975)(其中与环境因素形成对比，遗传力的 变化性是遗传学的函数)。亚麻酸的遗传力的复杂性可以是由于如下的事实，即亚麻酸可由C18:2的去饱和或C16:3的延长而合成(Thompson, 1983)。与亚麻酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于确定包含fad‑3c基因的芸苔植物的接合性的方法，所述方法包括：自所述芸苔植物获得基因组DNA样品；通过使所述基因组DNA样品与第一引物和第二引物接触产生接触样品，其中所述第一引物优先结合在感兴趣的单核苷酸多态性位置上游的所述fad‑3c基因的区域，所述第二引物优先结合在感兴趣的单核苷酸多态性位置下游的所述fad‑3c基因的区域，其中所述第一引物和所述第二引物在受到聚合酶链式反应(PCR)条件处理时生成扩增子；使所述接触样品进行PCR条件处理，其中生成所述扩增子；容许第一荧光探针和第二荧光探针中每种于50‑70摄氏度的温度与所述扩增子杂交一段时间，所述第一荧光探针在所述感兴趣的单核苷酸多态性不存在于所述扩增子中时优先与所述扩增子杂交，所述第二荧光探针在所述感兴趣的单核苷酸多态性存在于所述扩增子中时优先与所述扩增子结合；在所述容许步骤中规定的时间段后提高所述温度；在提高步骤期间捕捉由所述第一和第二探针中每种产生的所述荧光；并确定所述芸苔植物的接合性，确定步骤包括比较由所述第一和第二探针中每种产生的所述荧光，其中主要反映纯合SNP阳性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述感兴趣的单核苷酸多态性的存在，主要反映纯合SNP阴性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述感兴趣的单核苷酸多态性的存在的缺乏，且主要反映杂合SNP阳性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述芸苔植物包含含有所述感兴趣的单核苷酸多态性的第一等位基因和缺乏所述感兴趣的单核苷酸多态性的第二等位基因。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.21 US 61/550,1701.一种用于确定包含fad-3c基因的芸苔植物的接合性的方法，所述方法包括: 自所述芸苔植物获得基因组DNA样品； 通过使所述基因组DNA样品与第一引物和第二引物接触产生接触样品，其中所述第一引物优先结合在感兴趣的单核苷酸多态性位置上游的所述fad-3c基因的区域，所述第二引物优先结合在感兴趣的单核苷酸多态性位置下游的所述fad_3c基因的区域，其中所述第一引物和所述第二引物在受到聚合酶链式反应(PCR)条件处理时生成扩增子； 使所述接触样品进行PCR条件处理，其中生成所述扩增子； 容许第一荧光探针和第二荧光探针中每种于50-70摄氏度的温度与所述扩增子杂交一段时间，所述第一荧光探 针在所述感兴趣的单核苷酸多态性不存在于所述扩增子中时优先与所述扩增子杂交，所述第二荧光探针在所述感兴趣的单核苷酸多态性存在于所述扩增子中时优先与所述扩增子结合； 在所述容许步骤中规定的时间段后提高所述温度； 在提高步骤期间捕捉由所述第一和第二探针中每种产生的所述荧光；并 确定所述芸苔植物的接合性，确定步骤包括比较由所述第一和第二探针中每种产生的所述荧光，其中主要反映纯合SNP阳性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述感兴趣的单核苷酸多态性的存在，主要反映纯合SNP阴性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述感兴趣的单核苷酸多态性的存在的缺乏，且主要反映杂合SNP阳性对照样品中产生的荧光的所述第一和第二探针的荧光指示所述芸苔植物包含含有所述感兴趣的单核苷酸多态性的第一等位基因和缺乏所述感兴趣的单核苷酸多态性的第二等位基因。2.权利要求1的方法，其中所述扩增子由91-154个...

【专利技术属性】
技术研发人员：LC尤巴亚塞纳，Z埃勒特，CSA钱纳巴萨瓦拉德亚，M古普塔，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US