一种绵羊肺炎支原体体外培养基及制备方法技术

本发明专利技术公开一种绵羊肺炎支原体体外培养基，以及这种培养基的制备方法。本发明专利技术的绵羊肺炎支原体体外培养基制备方法是将：胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、乳糖、酵母浸出液和酚红混合后高压灭菌,待前述混合物晾凉至37℃以下后再在其中加入灭活健康猪血清100-200mL/L和经过灭菌水溶解的青霉素20万U/L，然后再用NaOH调pH值到7.4-7.8，得到培养基。本发明专利技术的培养基培养绵羊肺炎支原体仅24小时即可生长，生长滴度可达到10-10ccu，而且培养基的组成相比现有技术简单，成本更加低廉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细菌培养基及其制备方法，确切讲本专利技术涉及一种绵羊肺炎支原体体外培养基，以及这种培养基的制备方法。
技术介绍
绵羊肺炎支原体是一种介于细菌与病毒之间的无细胞壁结构的原核微生物，主要引起绵羊、山羊、尤其是羔羊增生性间质性肺炎。最早由Mackay等人(1963)从患有肺腺癌的绵羊肺中分离得该病原，随后Carmichael (1972)将它命名为绵羊肺炎支原体。此后在很多个国家和地区都报道有该病原的存在，如新西兰、匈牙利、冰岛、英国、澳大利亚、西班牙、土耳其、非洲及西亚的许多国家(Jonas et al, 1991;Linvingstonetal, 1979),给养羊业的发展造成了巨大的经济损失。我国最早由胡景韶等(1982)从发病绵羊上分离到了绵羊肺炎支原体，随后甘肃、辽宁、四川、云南、江苏和新疆等地都有从患肺炎的绵羊肺中分离到Mo的病例，并确定是引起当地绵羊增生性间质性肺炎的病因(逯忠新等，1993 ;谢守栋等，1985)，证明中国确实存在该病原。近年来，随着我国养殖业的发展，由Mo引起的疾病先后在我国很多地方都有报道，如甘肃、宁夏、四川、云南、江苏、辽宁、内蒙、山东、新疆、广西、湖北等地(方畴鑫等，1998 ;侯明学等，2000 ;蒋玉雯等，2000 ;刘少华等，2000) ，说明该病已在我国广泛分布和流行，危害日趋严重。在研究或制备用于防治因绵羊肺炎支原体弓丨起的疾病药物工作中，或者在研究绵羊肺炎支原体的病理特征等工作中均需要对绵羊肺炎支原体进行体外培养。绵羊肺炎支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁，生长条件严格，生长缓慢，由于其基因组较小，生物合成及代谢能力有限，病原细胞需要的多种营养物质需要从外界摄取，因此对培养基的要求较高。现阶段所使用的人工培养基中除基础营养外，还需要牛心浸液、酵母液、辅酶1、氨基酸等成份，另外还需加入10%~20%的动物血清，以及其它多种成分,其配置复杂,工艺繁琐，而且成本较高(参考:支原体学第2版吴移谋，叶元康著)虽然经过了很多次的改良，形成了改良的KM2培养基，在原来的基础上减少了很多工序。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足的绵羊肺炎支原体体外培养基，同时提供这种培养基的制备方法。本专利技术的绵羊肺炎支原体体外培养基制备方法是将胰蛋白胨15_20g/L，大豆蛋白胨5-8g/L，氯化钠5g/L，乳糖8-12g/L，酵母浸出液80_100mL/L，4.5%的酚红7-9 mL/L混合后高压灭菌，待前述混合物晾凉至37°C以下后再在其中加入灭活健康猪血清100-200mL/L和经过灭菌水溶解的青霉素20万U/ L，然后再用NaOH调pH值到7.4-7.8，得到培养基。酵母浸出液的配制方法为:先将鲜酵母膏500g，加入双蒸水2000ml中，搅拌溶解，然后用浓盐酸:水以=1:1 (体积比)调PH至4.5-5.0，再在80°C水浴处理，然后再离心处理，取上清液，将上清液用NaOH调PH至7.8-8.0,煮沸，置室温放凉后过滤，再补水至2000ml，-20°C保存备用。根据前述方法可制备出本专利技术的绵羊肺炎支原体体外培养基。本专利技术的培养基生长滴度和生长速度都要比改良的KM2培养基效果好，采用本专利技术的培养基培养绵羊肺炎支原体仅24小时即可生长，生长滴度可达到10_1(ICCU，而且培养基的组成相比现有技术简单，成本更加低廉。原有改良KM2培养基需要配置hanks液，需要加入MEM，配置复杂，繁琐，且生长时间较长，一般3-5天生长I代，相同菌种以及相同接种量生长滴度最高达到10_7CCU，且配制本专利技术培养基比较容易，再不需要Hanks液体的配制和MEM 经过反复试验表明，采用本专利技术的培养基培养绵羊肺炎支原体仅24小时即可生长，生长滴度可达到10_1(ICCU，而且培养基的组成相比现有技术简单，成本更加低廉。原有改良KM2培养基需要配置hanks液，需要加入MEM，配置复杂，繁琐，且生长时间较长，一般3_5天生长I代，相同菌种以及相同接种量生长滴度最高达到10_7CCU。【具体实施方式】以下是本专利技术的一个实施例。配置1000mL绵羊肺炎支原体培养基:首先量取500mL的双蒸水，然后秤取胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，，加入10.5g乳糖，酵母浸出液25% IOOmL, 4.5%的酚红9mL，定容到900 mL，121°C高压灭菌20分钟，高压后，取出晾凉至37°C以下，加无菌灭活健康猪血清100 mL，加经过灭菌水溶解的青霉素20万U/L，用IM NaOH调pH值到7.5，摇匀。置4°C冰箱备用。取相同体积的本培养基及KM2培养基进行滴度培养，结果显示，本专利技术培养基在24小时颜色就发生变化，而KM2培养基需要72小时颜色才发生变化，本专利技术培养基在接种第5天生长滴度达到10_1(lCCu，KM2培养基第5天生长滴度达到10_5ccu。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绵羊肺炎支原体体外培养基制备方法，其特征在于将：胰蛋白胨 15‑20g/L，大豆蛋白胨5‑8g/L，氯化钠5g/L，乳糖8‑12g/L，酵母浸出液80‑100mL/L，4.5%的酚红7‑9 mL/L混合后高压灭菌, 待前述混合物晾凉至37℃以下后再在其中加入灭活健康猪血清100‑200 mL/L和经过灭菌水溶解的 青霉素20万U/ L，然后再用NaOH调pH值到7.4‑7.8，得到培养基，酵母浸出液的配制方法为：先将鲜酵母膏500g,加入双蒸水2000ml中,搅拌溶解，然后用浓盐酸：水以=1:1（体积比）调PH至4.5‑5.0，再在80℃水浴处理，然后再离心处理，取上清液，将上清液用NaOH调PH至7.8‑8.0，煮沸，置室温放凉后过滤，再补水至2000ml,‑20℃ 保存备用。

【技术特征摘要】
1.一种绵羊肺炎支原体体外培养基制备方法，其特征在于将:胰蛋白胨15-20g/L，大豆蛋白胨5-8g/L，氯化钠5g/L，乳糖8-12g/L，酵母浸出液80_100mL/L，4.5%的酚红7-9mL/L混合后高压灭菌，待前述混合物晾凉至37°C以下后再在其中加入灭活健康猪血清100-200 mL/L和经过灭菌水溶解的青霉素20万U/ L，然后再用NaOH调pH值到7.4-...

【专利技术属性】
技术研发人员：逯忠新，贺英，赵萍，储岳峰，陈胜利，张建军，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62