泌尿生殖道支原体培养基及检测方法技术

本发明专利技术涉及泌尿生殖道微生物培养及检测方法，具体涉及泌尿生殖道解脲脲原体（Ｕｕ）和人型支原体（Ｍｈ）培养基和检测方法。培养基由液体和固体组成，在培养、分离、鉴别支原体时组合使用。配方含有胰酶大豆肉汤、酵母浸液、尿素、精氨酸、Ｌ－半胱氨酸、酚红、ＨＥＰＥＳ液、小牛（胎牛）血清、硫酸锰、万古霉素、两性霉素Ｂ、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素、青霉素等的要素，优化了维持支原体生长的营养、抑制杂菌生长抗生素组合，接种和转种样品不需要微孔滤器，支原体生长迅速；液体培养基具有维持和延长支原体生长对数期、指示生长；固体培养基观察Ｕｕ和Ｍｈ菌落，与背景反差大容易鉴别，显著提高了泌尿生殖道支原体检测的敏感性和特异性。

Urogenital tract mycoplasma culture medium and detection method

The invention relates to a microbiological culture and detection method for urogenital tract, in particular to a culture medium for detecting urogenital Ureaplasma urealyticum (Uu) and Mycoplasma hominis (Mh) and a detection method thereof. The medium consists of liquid and solid, and is used in culture, isolation, and identification of mycoplasma. The formula contains tryptic soy broth, yeast extract, urea, arginine, cysteine, L phenol, HEPES liquid, Dallas (fetal bovine serum) element, manganese sulfate, vancomycin and amphotericin B, trimethoprim, polymyxin, penicillin, optimized to maintain nutrition, suppress the growth of Mycoplasma bacteria antibiotic, inoculation and transfers the samples do not need microporous filter, the growth of Mycoplasma rapidly; liquid medium has to maintain and extend the logarithmic growth phase, indicating the growth of Mycoplasma; solid culture medium to observe the Uu and Mh colony, and background contrast is easy to be identified, significantly improve the detection of urogenital mycoplasma sensitivity and specificity of.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及泌尿生殖道微生物培养及检测方法，具体涉及泌尿生殖道解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)的培养基和检测方法。
技术介绍
支原体是目前所知能独立生长，自行繁殖的最小微生物。它无细胞壁，分布广泛，能在人工培养基上生长，但是营养条件要求高。它们与泌尿生殖道炎症密切相关，还能引起免疫性疾病。发病率高和致病性强的是解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)。它们与女性生殖道感染，如宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎以及一些并发症如自然流产、胎膜早破、早产等有关。Uu还可吸付精子上，阻碍其运动，干扰精子与卵子结合，引起不孕；还是引起新生儿呼吸系统和中枢神经系统感染的病原体之一。2000年后，中国在其他传染性疾病报告病例趋于稳定或下降背景下，NGU (非淋菌性尿道炎)报告病例依然呈快速上升趋势，2004年2005年全国由Uu和Mh等微生物感染所引起的NGU占到七种性病之首，构成分别达35. 94%和36. 78%。 2005年上海地区NGU发病率达到56. 87/10万。发病形势严峻。检测Uu和Mh的方法有免疫学检测、核酸测定、分离培养等。支原体属内不同种的支原体存在着交叉免疫反应，有些支原体还存在着异质性抗原，因此免疫性检测方法目前应用受到限制。鉴于PCR检测中存在的严重假阳性问题，中国卫生部颁布了规范性文件，对临床应用此项技术开展实验诊断的单位和部门，设定严格的准入条件。况且目前为止国内市场上还没有一个合法的临床诊断试剂盒供应，因此短期内普遍开展还有难度。分离培养一直是微生物检测的"金标准"，也是支原体检测最常用的方法。纵览国内有关泌尿生殖道支原体培养的文献发现，支原体的鉴定主要依据液体培养，它依据Uu利用尿素和Mh以精氨酸为能源，分解产氨和二氧化碳，使pH值升高，含酚红指示剂的培养液由黄色变红色提示支原体生长。虽然液体培养基使用方便、快速、判断容易，事实上泌尿生殖道中某些微生物含有脲酶，能生物利用液体培养基中某些成份，使pH升高而改变颜色，出现严重的的假阳性。广谱抗生素的广泛使用，微生物的耐药性出现了很大的变迁，泌尿生殖道寄居的微生物呈现多样化。杂菌的存在， 一定程度上竞争Uu生长所需的营养，呈优势生长而干扰支原体最终的结果判断。另外，产尿素酶杂菌的生长导致酸碱变化，也可造成Uu液体培养结果的错误判断。固体培养通过显微镜观察有无油煎蛋状菌落生长、形态特征等性状鉴别多种支原体，但是国产固体培养基在质量上与进口的A7固体培养基相比有较大差距。进口固体培养基价格昂贵，定购周期长，培养基交得于薄可能影响检测效耒。另外，直接将样品接种到固体培养基中，其检测阳性率较低。临床实践发现，大量商品化独立使用的支原体液体、或者固体培养基产品，在敏感性和特异性方面存在较大差异，即使同一品牌的液体培养的阳性率显著高于固体培养，目前尚无优质的组合使用的支原体培养基及制备方法。
技术实现思路
本专利技术是提供检测泌尿生殖道Uu和Mh的培养基及检测方法，根据2种支原体生物学特性，优化了维持支原体生长的营养、抑制杂菌生长抗生素的组合。突出了液体培养基可以提高阳性率、固体培养基避免了其他微生物因为改变颜色造成的假阳性，并且显著提高了固体培养的阳性率。当组合使用，提高了泌尿生殖道Uu和Mh支原体检测的敏感性和特异性。本专利技术提供的泌尿生殖道支原体培养基和检测方法，其特征是含有胰酶大豆肉汤、酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红、HEPES液、小牛血清、硫酸锰、万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素、青霉素等要素的配方，并且液体培养基和固体培养基在培养、分离、鉴别泌尿道支原体时组合使用。液体培养基用于接种临床样品、抑制杂菌、具有同时促进Uu和Mh支原体生长、指示是否有支原体生长；固体培养基用于观察培养物是否支原体、鉴别解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)。本专利技术提供的泌尿生殖道支原体培养基和检测方法，具有促进支原体的生长，延长Uu在液体中生长对数期时间，降低因为pH升高导致Uu转种到固体培养基的假阴性率，转种过程不需要微孔过滤装置虑除细菌，固体培养中抑制杂菌的效果显著，支原体生长迅速，Uu和Mh在24小时就可以出现菌落，背景干扰少，Uu和Mh菌落形态典型，容易鉴别，Uu和Mh在固体和液体培养的阳性率比较吻合，临床样品的检测阳性率高。本专利技术提供的泌尿生殖道支原体培养基和检测方法包括-.、液体培养基每1000ml液体组成:1.胰酶大豆肉汤5~10 g2.NaCl3~7 g3.磷酸二氢钾0.02~0.5 g4.酵母浸液5~20 g5.尿素1 5 g6.精氨酸0.1~1 g7.L-半胱氨酸20~50 mg8.服PESO.O卜l g9.酚红5 30 mg10.万古霉素0.1 ~5 mg11.两性霉素B10 50 nl12.甲氧苄氨嘧啶0.1~5 mg13.多粘菌素0.3~6 mg14.小牛血清兩 ml15.蒸馏水至1000 ml-2-二、固体培养基每lOOOml体积组成:1. 胰酶大豆肉汤2. 硫酸锰0.01~0.033. 琼脂4. 蒸馏水5. 小牛血清6. 酵母浸液7. 尿素8. 精氨酸9. L-半胱氨酸10. 青霉素(钾盐)G 10万U/ml11. 两性霉素B12. 蒸馏水1~3 g0.1~0.5 g0.1~0.5 g20-30 mg0.01~0.02 g10~20 |il至1000 ml三、其检测方法是液体培养基和固体培养基在培养、分离、鉴别泌尿生殖道支原体时组合使用。将样品拭子直接置液体培养基中搅拌十次、或者液状样品取10(HU注入液体培养基中，培养4至24小时，无论液体培养基是否改变颜色，不需要微孔过滤器，直接取出10nl 50pl滴种或者划线转种到固体培养基上，培养24小时后，在10倍物镜下观察是否有支原体生长。固体培养基上的支原体具有金属光泽，Uu呈现棕黑色海胆状菌落，Mh呈现比Uu明显大的"煎蛋"形态典型菌落，与背景反差大容易鉴别。泌尿生殖道支原体培养基的配置包括以下程序一、 液体培养基的配置1. 称取胰酶大豆肉汤干粉5~10g,在600ml纯化水中溶解；2. 加入NaCl 3~7g和磷酸二氢钾0.02~0.5g;3. 用1N的HCL调正pH至6.2土0.1，置121。C高压灭菌15分钟，冷却到56'C备用；4. 分别称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红，加入适量灭菌纯化水溶解；5. 经过0.22pm过滤器后加人到冷却的培养基中；6. 按照配方分别称取万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶和多粘菌素，在适量灭菌纯化水溶解，加入到上述培养基中；7. 加入小牛血清100ml;8. 补足]OOOml体积培养基；9. 用1N的HCL调正pH至6,2土0.2后，分装至经过高压灭菌的螺口瓶中，置2 8。C保存备用。二、 固体培养基的配置l.分别称取胰酶大豆肉汤干粉、琼脂粉、硫酸锰，加入500ml纯化水溶解；2. 用IN的HCL调正pH至6. 2±0. 1溶解后；3. 置12rC高压灭菌15分钟，冷却到56'C备用；4. 称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红，加入适量灭菌纯化水溶解；5. 经过0. 22 u m过滤器后，加入到保温的培养基中；6. 分别称取两性霉素B和青霉素，在适量灭菌纯化水溶解，加入到上述培养基中；7. 本文档来自技高网...

【技术保护点】
泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征的组成是由液体和固体培养基组成，根据解脲脲原体（Ｕｕ）利人型支原体（Ｍｈ）生物学特性，优化了维持支原体生长的营养和环境、抑制杂菌生长抗生素组合，具体涉及培养基配方特征是含有胰酶大豆肉汤、酵母浸液、尿素、精氨酸、Ｌ－半胱氨酸、酚红、ＨＥＰＥＳ液、小牛（胎牛）血清、硫酸锰、万古霉素、两性霉素Ｂ、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素、青霉素等的要素和组合；具体涉及其液体培养基和固体培养基在培养、分离、鉴别泌尿生殖道支原体时组合使用，突出了培养基抑制杂菌能力，接种和转种样品不需要微孔滤器，支原体生长迅速；液体培养基具有维持和延长支原体生长对数期、指示生长；固体培养基观察Ｕｕ和Ｍｈ菌落，与背景反差大容易鉴别，其特征是避免了其他生物利用液体培养基中营养的微生物而引起的假阳性或假阴性，显著提高了泌尿生殖道支原体检测的敏感性和特异性。　（１）泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是培养基的要素和组合包括：　Ａ：液体培养基每１０００ｍｌ液体组成：　１．胰酶大豆肉汤　５～１０ｇ　２．ＮａＣｌ　３～７ｇ　３ ．磷酸二氢钾　０．０２～０．５ｇ　４．酵母浸液　５～２０ｇ　５．尿素　１～５ｇ　６．精氨酸　０．１～１ｇ　７．Ｌ－半胱氨酸　２０～５０ｍｇ　８．ＨＥＰＥＳ　０．０１～１ｇ　９．酚红　５～３０ ｍｇ　１０．万古霉素　０．１～５ｍｇ　１１．两性霉素Ｂ　１０～５０μｌ　１２．甲氧苄氨嘧啶　０．１～５ｍｇ　１３．多粘菌素　０．３～６ｍｇ　１４．小牛血清　１００ｍｌ　１５．蒸馏水　至１０００ ｍｌ　Ｂ：固体培养基每１０００ｍｌ体积组成：　１．胰酶大豆肉汤　１０～５０ｇ　２．硫酸锰　０．０１～０．０３ｇ　３．琼脂　１１ｇ　４．蒸馏水　５００ｍｌ　５．小牛血清　２００ｍｌ　６．酵母 浸液　１～３ｇ　７．尿素　０．１～０．５ｇ　８．精氨酸　０．１～０．５ｇ　９．Ｌ－半胱氨酸　２０～３０ｍｇ　１０．青霉素（钾盐）Ｇ　１０万Ｕ／ｍｌ　０．０１～０．０２ｇ　１１．两性霉素Ｂ　１０～２０ μｌ　１２．蒸馏水　至１０００ｍｌ　（２）泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其检测方法的特征是液体培养基和固体培养基在培养、分...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾伟鸣，吴磊，杨阳，
申请(专利权)人：上海市皮肤病性病医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]