本发明专利技术将一种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白。其原理是通过NaOH碱液加热处理，使几丁质发生脱乙酰作用，此后再通过乙酸处理使其乙酰化，从而得到部分脱乙酰化的几丁质衍生物，将这种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域的融合蛋白，可以很好地改善其对含有几丁质结合域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白的特异性吸附效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程产品下游分离纯化领域，涉及将部分脱乙酰的几丁质衍生物应用于特异性吸附分离纯化含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain,CBD)的融合蛋白。
技术介绍
当采用基因工程技术表达一些外源性多肽或小分子蛋白时，表达产物往往会由于被宿主细胞内的蛋白酶降解而造成表达量大大降低。为了有效解决这一问题，目前普遍采用融合表达技术。所谓融合表达就是通过基因重组技术将外源小分子蛋白(多肽)拼接于融合伴侣(标签)下游进行表达，然后通过酶切或化学切割释放出目的小分子蛋白(多肽)的技术。在进行基因拼接融合时应保持目的小分子蛋白(多肽)编码基因与融合伴侣(标签)编码基因阅读框架一致。此外，在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间需要设计I个或I个以上的蛋白酶切位点(如肠激酶切割位点)或化学切割位点或可以自己切割的蛋白内含子(intein)，这样就可以在融合蛋白表达出来之后通过酶切或化学切割或诱导自切割等手段释放出目的小分子蛋白(多肽)。采用融合伴侣(标签)进行融合表达的优点在于:⑴对分子量较小的外源目的小分子蛋白(多肽)进行融合表达可增强表达产物的稳定性，减少或避免宿主细胞蛋白酶对表达产物的降解；(2)某些融合伴侣(标签)可以增强目的蛋白或多肽的可溶性；(3)方便目的蛋白的分离纯化。目前普遍使用在低等生物或细菌中，以可溶性状态高表达的蛋白作为融合伴侣(标签)以提高目的小分子蛋白(多肽)的表达量、可溶性及稳定性，采用的融合伴侣(标签)有曼氏血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST，28kDa)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP，40kDa)、蛋白二硫化物异构酶(NusA, 55kDa)、大肠杆菌二硫键异构酶(Dsb A,21kDa)等。除了上述融合伴侣以外，环状芽孢杆菌几丁质结合结构域(Chitin BindingDomain, CBD, 5kDa)也是一种较为理想的分子融合伴侣，与之进行融合表达的产物便可以通过与几丁质的特异性吸附进行分离纯化。然而，天然几丁质是一种由N-乙酰氨基葡萄糖以β_1，4糖苷键组成的直链多聚体，性质比较稳定，不溶于水、稀碱、稀酸以及大部分有机溶剂，直接应用于含几丁质结合域融合蛋白的分离纯化其吸附效果往往不够理想。由于天然几丁质结构中含有大量的-OH和-ΝΗ2基团，可以对其进行化学修饰制备各种衍生物，以改善其理化性质。为此，本专利技术通过将几丁质进行脱乙酰化作用以及乙酰化作用对其活化后，将之应用于含几丁质结合结构域的融合蛋白的吸附分离纯化，大大改善了其对含有几丁质结合结构域的融合蛋白的吸附效果。
技术实现思路
本专利技术将一种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白。其原理是通过NaOH碱液加热处理,使几丁质发生脱乙酰作用，此后再通过乙酸处理使其乙酰化，从而得到部分脱乙酰化的几丁质衍生物，将这种部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域的融合蛋白，可以很好地改善了其对含有几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白的特异性吸附效果。【附图说明】图1、本专利技术构建的pTWINl-lun融合表达质粒图谱。CBD:几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain, CBD)基因；intein splicing site 为 Ssp DnaB 蛋白内含子自切割位点；LUN为Iunasin编码基因图2、CBD_Ssp DnaB intein-lunasin融合蛋白的基因编码序列。CBD:几丁质结合结构域基因序列；Ssp DnaB intein:可自切割的蛋白内含子基因序列；lunasin:lunasin编码基因图 3、融合蛋白 CBD-Ssp DnaB intein-lunasin 在培养基中表达的 15% SDS-PAGE电泳图。泳道M:分子量标准蛋白质(kDa)，分子量分别为116.0, 66.2，45.0, 35.0, 25.0, 18.4，14.4(自上而下)；泳道1:未经乳糖诱导的发酵液菌体破菌上清；泳道2:经0.2% (w /V)乳糖诱导表达的发酵液菌体破菌上清图 4、融合蛋白 CBD-Ssp DnaB intein-lunasin 的 Western Blot 鉴定分析图谱。一抗为兔抗Iunasin抗体，二抗为羊抗兔抗体。泳道1:大肠杆菌宿主菌E.coli BL21(DE3)发酵液菌体破菌上清(对照组);泳道2:工程菌pTWINl-lun / E.coli BL21(DE3)经0.2%(w / v)乳糖诱导表达的发酵液菌体破菌上清图5、本专利技术制备的部分脱乙酰化的几丁质衍生物层析柱纯化产物的Tricine / SDS-PAGE电泳图。泳道M:分子量标准蛋白质(kDa)，分子量分别为100，30，25，20，15，10, 5,3.4(自上而下)；泳道1_4:部分脱乙酰化的几丁质衍生物层析柱纯化产物图6、本专利技术制备的部分脱乙酰化的几丁质衍生物柱层析及RP-HPLC纯化后的Iunasin质谱鉴定图【具体实施方式】实施例1部分脱乙酰化的几丁质衍生物柱材的制备取30g几丁质(阿拉丁试剂(上海)有限公司)于1000mL烧杯中，加200mL双蒸水浸泡过夜；倾倒掉双蒸水，加入500mL2mol / L HCl浸泡2h，抽滤，之后水洗至中性；再加500mL I mol / L NaOH浸泡，并将烧杯至于100°C水浴锅中水煮lh，抽滤，再水洗至中性；再加500mL0.01mol / LNaOH浸泡，将烧杯至于50°C水浴锅中水煮lh，抽滤，水洗至中性；再加500mL0.01mol / LCH3COOH,将烧杯至于50°C水浴锅中水煮0.5h，抽滤，水洗至中性。最后将经过处理的几丁质置于真空干燥器中进行真空干燥处理，真空干燥器温度不宜超过80°C，完全干燥之后将几丁质置于研钵中进行研磨，常温真空干燥保存，备用。实施例2含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain, CBD)的融合蛋白的设计与克隆根据Iunasin 多肽的氨基酸序列，采用 OPTIMIZER (http: / / genomes.urv.es/OPTIMIZER)和 Gene Designer (http: / / www.DNA20.com)软件以及大肠杆菌偏爱的密码子设计了 Iunasin多肽的基因编码序列，并在其两侧添加了 Sap I和Pst I酶切位点。通过重叠延伸PCR方法得到了两侧含Sap I和Pst I酶切位点的Iunasin多肽编码基因序列，并 TA-克隆到 pMD?19-T Simple Vector (TaKaRa Biotech (大连)公司产品)中，Sap I 和Pst I双酶切后，再亚克隆到pTWINl载体(New England Biolabs公司产品)中，得到重组质粒pTWINl-lun (图1),其中融合表达基因依次包括几丁质结合结构域(Chitin BindingDomain, CBD)基因、Ssp DnaB蛋白内含子基因以及Iunasin编码基因(图2)。该融合表达质粒转化大肠杆菌宿主E.coli BL21(DE3)菌感本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种将部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域(Chitin Binding Domain，CBD)的融合蛋白的方法。
【技术特征摘要】
1.一种将部分脱乙酰化的几丁质衍生物应用于分离纯化含几丁质结合结构域(...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭树华，张怡，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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