粘附性细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供用于能够通过与二维培养同样的培养方法在接近于生物体内的环境下评价粘附性细胞的方法及其用途。粘附性细胞的培养方法中，作为培养容器(10)，使用配置2个以上等效直径D为期望的球状体的直径的1倍～5倍且高度H为上述等效直径的0.3倍～5倍的培养空间(11)、并且表面的水接触角为45度以下的容器。在配置于培养容器(10)中的多个培养空间(11)分别培养粘附性细胞的球状体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过与以往的二维培养(平面上的培养)同样的操作培养出不可能通过二维培养得到的均匀尺寸的粘附性细胞的球状体的方法。
技术介绍
近年来，利用细胞培养技术培养的细胞开始用于药剂的药效试验、毒性试验。但是，对于通过以往的培养技术培养的细胞而言，细胞在二维方向上铺展，形成与在生物体内大大不同的形状。因此，存在不具有本来的细胞功能，不能反映药物在生物体内的行为的问题。因此，近年来，模仿生物体内的组织形态的球状体培养方法开始受到关注。例如，公开了使96多孔板的底面呈漏斗状且在其中形成1个球状体的方法(专利文献1)。另外，可以列举：通过在培养底面上形成微细的蜂窝结构体而减弱细胞对机材的粘附性来形成球状体的方法(专利文献2)、使用外源性细胞聚集剂的方法(专利文献3)等。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第2716646号公报专利文献2：日本特开2002-335949号公报专利文献3：日本特开2008-22743号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的问题但是，专利文献1的培养方法中，在一个容器内以悬浮的状态形成1个球状体。该方法中，更换培养基时细胞容易脱离，因此，存在更换培养基时操作繁琐的问题。此外，由于在一个容器内形成1个球状体，因此难以应用于例如6孔板、12孔板、24孔板、384孔板或者烧瓶形状的容器。另外，专利文献2、3的培养方法能够应用于上述的培养板、烧瓶形状的容器，但另一方面，不能控制球状体的大小。因此，存在不能制作具有均匀直径的球状体的问题。由此可见，以往的培养方法在市售的孔板、烧瓶形状的容器中的应用存在限度，或者即使能应用也难以控制球状体的直径。因此，要求能够应用于各种培养容器的形状、且通过控制球状体的大小能够培养具有均匀直径的粘附性细胞的球状体的新方法。用于解决问题的方法本专利技术的粘附性细胞的培养方法的一个方式中，作为培养容器，选择配置2个以上等效直径为期望的球状体的直径的1倍～5倍且高度为上述等效直径的0.3倍～5倍的培养空间、并且该培养空间表面的水接触角为45度以下的容器。在配置于选择的培养容器中的多个培养空间内分别培养粘附性细胞的球状体。通过使用形成有与要培养的球状体的尺寸相应的培养空间的培养容器，对培养的球状体的尺寸进行控制。由此，能够得到期望尺寸的球状体。本专利技术的粘附性细胞的培养方法的一个方式中，优选培养空间的等效直径为100μm～5000μm的范围。此外，优选将相邻的培养空间隔开的壁的厚度为5μm～50μm的范围，优选将相邻的上述培养空间隔开的壁的上表面与侧面所成的角度为90度～135度的范围。另外，优选在培养后的全部球状体中，有60%以上的球状体，其直径在培养后的球状体的直径的平均值的正负5%的范围内，优选球状体为癌细胞。此外，优选培养容器为包含丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯类树脂、丙烯酸-苯乙烯类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯类树脂和硅树脂中的1种或它们的组合的树脂成形品。此外，优选培养空间的表面以通过玻璃处理或通过等离子体处理形成官能团而使水接触角为45度以下的方式进行了处理。此外，优选对培养空间的表面实施了下述中的任何一项：包被有通过温度、光中的任何一种使亲水性和疏水性发生变化的聚合物；固定有抑制细胞粘附的亲水性聚合物链；固定有磷脂或磷脂-高分子复合物。专利技术效果通过本专利技术，能够通过与以往的二维培养同样的操作高密度地培养均匀尺寸的粘附性细胞的球状体。附图说明图1是表示本专利技术的实施方式的培养容器的构成例的图。图2是图1所示的培养容器的沿II-II线的剖面图。图3是说明在培养板的孔内形成有本实施方式的培养容器的构成例的示意图。图4是表示在培养空间内培养球状体的状态的示意图。图5A是表示培养空间的另一形状例的图。图5B是表示培养空间的又一形状例的图。图6A是表示培养空间的另一侧面的形状例的剖面图。图6B是表示培养空间的又一侧面的形状例的剖面图。图6C是表示培养空间的又一侧面的形状例的剖面图。图7是表示实施例1的结果的照片。图8是表示实施例2的结果的照片。图9是表示比较例1的结果的照片。图10是表示比较例2的结果的照片。图11是表示实施例3的结果的照片。具体实施方式以下，参考附图对本专利技术的实施方式进行说明。但是，本专利技术并不限定于以下的实施方式。为了明确说明，以下的记载和附图进行了适当省略和简化。各附图中，对具有同一构成或功能的构成要素和相应部分赋予同一标号，并省略其说明。图1中示出了本专利技术的实施方式的培养容器的构成例。图2中示出了沿图1的II-II线的剖面图。培养容器10具有培养空间11、壁12和底部13。培养空间11为由壁12和底部13分隔成的区域，成为培养细胞的三维空间区域(培养区域)。培养空间11也简称为“空间”或“微空间”。壁12为分隔培养空间11的隔壁，也可以说是在培养容器10上形成凹凸图案的凸部。底部13作为培养容器10的基板发挥功能，并且，配置培养空间11的一侧的表面成为培养区域(培养表面)的一部分。图1、2中，关于培养容器10中的培养空间11，示出了等效直径D、高度H、壁12的宽度W(厚度)和底部13的厚度T。图1、2中，示出了底部13与壁12作为一体而制作的情况。等效直径D是指与培养空间11内切的内切圆的直径。更详细而言，等效直径D是指与培养空间11的底部13平行的面的形状(正面的形状)的内切圆的直径，换言之，是指与培养空间11的高度H的方向垂直的面的形状的内切圆的直径。在培养空间11的正面的形状随着高度H而不同的情况下，将培养粘附性细胞的空间区域的最大值作为等效直径。高度H为从培养空间11的底至壁12的上表面的长度，也可以说是培养空间11的深度。另外，在培养底面为平面的情况下，高度H与壁12的高度相同。壁12的宽度W也可以说是邻接的培养空间11之间的距离。本专利技术人发现，通过使用具有多个等效直径D为期望的球状体的直径的1～5倍且高度H(深度)为等效直径D的0.3倍～5倍的培养空间11、并且该培养空间表面的水接触角为45度以下的培养容器10，在各培养空间11内培养粘附性细胞，能够培养均匀直径的粘附性细胞的球状体。因此，通过根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粘附性细胞的培养方法，使用配置2个以上等效直径为期望的球状体的直径的1倍～5倍且高度为所述等效直径的0.3倍～5倍的培养空间、并且该培养空间表面的水接触角为45度以下的培养容器，在多个培养空间培养粘附性细胞的球状体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.20 JP 2011-2047961.一种粘附性细胞的培养方法，使用配置2个以上等效直径为期
望的球状体的直径的1倍～5倍且高度为所述等效直径的0.3倍～5倍的
培养空间、并且该培养空间表面的水接触角为45度以下的培养容器，
在多个培养空间培养粘附性细胞的球状体。
2.如权利要求1所述的培养方法，其中，所述培养空间的等效直
径为100μm～5000μm的范围。
3.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，将相邻的所
述培养空间隔开的壁的厚度为5μm～50μm的范围。
4.如权利要求1至3中任一项所述的培养方法，其特征在于，将
相邻的所述培养空间隔开的壁的上表面与侧面所成的角度为90度～135
度的范围。
5.如权利要求1至4中任一项所述的培养方法，其特征在于，在
培养后的全部球状体中，有60%以上的球状体，其直径在培养后的球
状体的直径的平均值的正负5%的范围内。
6.如权利要求1至5中任一项所述的培养方法，其特征在于，所
述球状体为癌细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述的培养方法，其特征在于，所
述培养容器为包含丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯类树脂、
丙烯酸-苯乙烯类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇
类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯类树脂和硅
树脂中的1种或它们的组合的树脂成形品。
8.如权利要求1至7中任一项所述的培养方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：江尻洋子，绫野贤，细田雅也，田崎刚，
申请(专利权)人：株式会社可乐丽，
类型：发明
国别省市：日本;JP