一种编码修饰的荧光素酶多肽和底物的分离的多核苷酸。OgLuc变体多肽与SEQ?ID?NO:1具有至少60%氨基酸序列同一性且在对应于SEQ?ID?NO:1中的氨基酸的位置处具有至少一个氨基酸置换。OgLuc变体多肽相对于野生型刺虾属荧光素酶的对应的多肽具有增强的发光、增强的信号稳定性和增强的蛋白质稳定性中的至少一项。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】一种编码修饰的荧光素酶多肽和底物的分离的多核苷酸。OgLuc变体多肽与SEQ?ID?NO:1具有至少60%氨基酸序列同一性且在对应于SEQ?ID?NO:1中的氨基酸的位置处具有至少一个氨基酸置换。OgLuc变体多肽相对于野生型刺虾属荧光素酶的对应的多肽具有增强的发光、增强的信号稳定性和增强的蛋白质稳定性中的至少一项。【专利说明】相关申请的交叉引用本申请要求于2010年11月2日提交的美国临时申请号61/409，422的优先权，其以其整体通过引用并入本文。背景已显示从深海奸细角刺奸(Oplophorus gracilirostris)分泌的突光素酶具有许多令人感兴趣的特点，比如高活性、高量子产量和宽泛的底物特异性(包括，例如，腔肠素(coelenterazine)以及多种腔肠素类似物)。当腔肠素(底物)与分子氧的氧化由刺虾属荧光素酶催化时，发生刺虾属的生物发光反应，导致462nm处的最大强度的光和产物CO2和 coelenteramide (Shimomura 等，Biochemistry, 17:994(1978))。最佳发光在 40°C 下在0.05-0.1M NaCl存在下在pH9时发生，并且，由于该酶对热的独特的耐性，当使用高纯度的酶时，可见发光在高于50°C的温度下发生，或当使用部分纯化的酶时，在高于70°C时发生。在pH8.7时，Shimomura等(1978)报道天然荧光素酶具有约130kDa的分子量，显然每个包括4个31kDa的单体；在较低pH时，天然荧光素酶趋于聚合。近期研究已显示细角刺虾荧光素酶是35kDa和19kDa天然蛋白质的复合物，S卩，由两个19kDa组分和两个35kDa组分组成的异四聚体。Inouye等(2000)报道了编码刺奸属荧光素酶的35kDa和19kDa蛋白质的cDNA的分子克隆，和催化发光反应的蛋白质组分的鉴定。编码所述蛋白质的cDNA在细菌细胞和哺乳动物细胞中表达，且19kDa蛋白质被鉴定为能够催化腔肠素的发光氧化反应的组分(Inouye等，2000)。刺虾属荧光素酶的19kDa蛋白(GenBank登录号BAB13776，196个氨基酸)似乎是具有荧光素酶功能的最小的催化组`分，且其一级结构与包括咪唑并吡嗪酮荧光素酶的任何所报道的荧光素酶不具有显著相似性(Lorenz等，PNAS USA, 88:4438 (1991) ；Thompson等，PNASUSA，86:6567 (1989))。19kDa蛋白质在大肠杆菌(E.coli)中的表达导致了包涵体的形成(Inouye 和 Sasaki, Protein Expression and Purification, 56:261-268 (2007))。包涵体的形成可能由于蛋白质的不稳定性导致。刺奸属萤光素酶的底物特异性出乎意料地广泛(Inouye和Shimomura.BBRC223:349 (1997))。例如，双脱氧腔肠素(bisdeoxycoelenterazine)(即，腔肠素-hh)，一种腔肠素类似物，是与腔肠素相当的刺虾属荧光素酶的极佳底物(Nakamura等，Tetrahedron, Lett.,38:6405(1997))。并且,刺奸属突光素酶是分泌的酶，与海相介形虫希根海萤(Cypridina (Vargula) hiIgendorfii)的突光素酶相似(Johnson 和 Shimomura,Meth.Enzyme, 57:331 (1978))，其也使用咪唑并吡嗪酮型荧光素来发光。概述在一方面，本公开涉及式(Ia)或(Ib)的化合物:【权利要求】1.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于非刺虾属荧光素酶具有增强的发光。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述非刺虾属荧光素酶是海肾属荧光素酶。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述非刺虾属荧光素酶是萤火虫荧光素酶。4.一种多核苷酸,所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一'I"生的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的OgLuc多肽具有增强的发光，条件是由所述多核苷酸编码的所述多肽不是表47中所列的那些其中之一。5.—种多核苷酸,所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一'I"生的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO: 31的多肽具有增强的发光，条件是由所述多核苷酸编码的所述多肽不是SEQ ID N0:3或15。6.—种多核苷酸,所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60%氨基酸序列同一'I"生的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换 ，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO: 29的多肽具有增强的发光，条件是由所述多核苷酸编码的所述多肽不是SEQ ID N0:3或15。7.如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽与SEQID NO:1具有至少80%氨基酸序列同一性。8.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽与SEQID NO:1具有至少90%氨基酸序列同一性。9.如权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQIDN0:3的所述多肽具有增强的蛋白质稳定性或增强的生物相容性中的至少一项。10.如权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于海肾属荧光素酶具有增强的酶稳定性或增强的生物相容性中的至少一项。11.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于萤火虫荧光素酶具有增强的酶稳定性或增强的生物相容性中的至少一项。12.如权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其中在腔肠素的存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID N0:3的多肽具有增强的发光。13.如权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸，其中在式(Ia)或(Ib)的化合物存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的多肽具有增强的发光: 14.如权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中与不同的腔肠素相比较在腔肠素的存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO: 3的多肽具有相对底物特异性的改变。15.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其中与天然的或已知的腔肠素相比较在式(Ia)或(Ib)的化合物存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO: 3的多肽具有相对底物特异性的改变: 16.如权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸,其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQID NO:3的所述多肽具有增强的生物相容性。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·宾科夫斯基，L·P·昂塞尔，M·哈尔，M·B·罗贝斯，M·R·斯莱特，K·V·伍德，M·G·伍德，
申请(专利权)人：普罗梅加公司，
类型：
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