具有增强的光输出的合成的刺虾萤光素酶制造技术

本发明专利技术涉及编码修饰的萤光素酶多肽的多核苷酸。所述修饰的萤光素酶多肽与野生型刺虾萤光素酶具有至少60％氨基酸序列相同性且在相应于SEQ?ID?NO：1所示野生型刺虾萤光素酶的氨基酸的位置具有至少一个氨基酸取代。所述修饰的萤光素酶多肽相对于野生型刺虾萤光素酶具有增强的发光性、增强的信号稳定性和增强的蛋白质稳定性中的至少一项。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增强的光输出的合成的刺虾萤光素酶相关申请的交叉参考本申请要求2009年5月1日申请的美国临时申请号61/174，838的优先权，其全文援引加入本文。
技术介绍
本专利技术涉及与野生型刺虾(Oplophorus)萤光素酶相比具有增强性质的合成的刺虾萤光素酶。深海虾细角刺虾(Oplophorus gracilirostris)当受刺激时从其触角基底部发出蓝色发光云，与各种其它发光的十足目虾一样，这些十足目虾包括异腕虾属 (Heterocarpus)、腹刺虫下属(Systellaspis)禾口棘虫下属(Acanthephyra)的那些(Herring, Τ. Mar. Biol. Assoc. UK, 156 1029 (1976))。刺虾的发光机制涉及由刺虾萤光素酶催化的刺虾萤光素(coelenterazine)与分子氧的氧化作用，如下式示出刺虾萤光素Coelenterazine +O2 _> Coelenteramide + CO2 + hv(Amax = 454 nm)Coelenterazine是一种咪唑并吡嗪酮(imidazopyrazinone)化合物，参与许多生物体的生物发光机制，如作为萤光素或者作为光蛋白的功能部分。例如，海肾Renilla 的萤光素是 coelenterazine(Inoue et al. , Tetrahed. Lett. , 18 :2685 (1977)),来自水母Aequorea的钙敏感性光蛋白水母发光蛋白也含有coe 1 enterazine作为其功能部分 (Shimomura et al. , Biochem. ,17 :994(1978) ；Head et al. , Nature,405 :372(2000))。专利技术概述在一个实施方案中，本专利技术提供了编码修饰的萤光素酶多肽的多核苷酸。所述修饰的萤光素酶与野生型刺虾萤光素酶具有至少60%氨基酸序列相同性并且在相应于SEQ ID NO :1所示野生型刺虾萤光素酶的氨基酸的位置包括至少一个氨基酸取代。所述修饰的萤光素酶多肽相对于野生型刺虾萤光素酶具有增强的发光性、增强的信号稳定性及增强的蛋白质稳定性中的至少一项。在另一个实施方案中，本专利技术提供了编码修饰的萤光素酶多肽的多核苷酸。所述修饰的萤光素酶多肽相对于野生型刺虾萤光素酶具有增强的发光性并且在相应于SEQ ID NO 1 的第 2、4、11、20、23、沘、33、；34、44、45、51、讨、68、72、75、76、77、89、90、92、99、104、 115、124、135、138、139、143、144、164、166、167或者169位置具有至少一个氨基酸的取代。通过本专利技术的详细描述和附图，本专利技术的其它方面将会变得明显。附图简述附图说明图1示出脂肪酸结合蛋白(FABP)和OgLuc的二级结构排列对比。图2示出腰鞭毛虫萤光素酶、FABP和OgLuc的二级结构排列对比。图 3 示出 OgLuc 和各种 FABP (分别为 SEQ ID NO :1、3、4、5 禾口 17-20)基于 FABP 的 3D结构重叠的氨基酸序列的排列对比。图4A-D示出用在OgLuc中两或更多个氨基酸取代组合修饰的OgLuc变体与m66R5OgLuc变体和Renilla萤光素酶相比的光输出(即发光)时程。4A-4B)使用“Flash” 发光测定在若干分钟时间以两种不同的发光标度示出的以相对光单位(RLU)示出的发光 (“lum”)。4C-4D)使用“Glo”0. 5% tergitol发光测定在若干分钟时间以两种不同发光标度示出的以RLU示出的发光(“lum”)。图5A-C概述了在实施例7中描述的T = 0时各种OgLuc变体(“样品，，)以RLU 表示的平均发光(平均值)及标准误差(Mdev)和与WT OgLuc相比的变异系数(CV)，使用 0. 5% tergitol测定缓冲液。图6A-B概述了从图5A-C示出的0. 5% tergitol测定缓冲液数据确定的OgLuc变体与WT OgLuc相比在T = 0的发光增加倍数。图7A-C概述了 OgLuc变体(“样品”)在T = 0的以RLU表示的平均发光(“平均值”)以及标准误差(“Stdev”)和与WT OgLuc相比的变异系数(“CV”)，使用RLAB。图8概述了从图7A-C示出的RLAB数据确定的OgLuc变体与WT OgLuc相比在T =0的发光增加倍数。图9A-D示出与WT OgLuc相比，OgLuc变体的信号稳定性，使用0. 5% tergitol测定缓冲液。9A-9C) =OgLuc变体(“克隆”)的光输出时程，在若干分钟内随时间测量以RLU 表示的发光。9D)从图9A-C示出的光输出时程数据确定的OgLuc变体的以分钟表示的信号半衰期。图10A-C示出使用RLAB，OgLuc变体与WT OgLuc相比的光输出时程(即信号稳定性)，在若干分钟内随时间测量以RLU表示的发光。图IlA-B示出从图10A-C所示光输出时程数据确定的OgLuc变体与WT OgLuc相比的以分钟表示的信号半衰期。图12A-B示出与WT OgLuc相比，OgLuc变体在22°C的蛋白质稳定性，以半衰期(分钟)表示。图13A-B 概述了使用 0. 5% tergitol 测定缓冲液(13A)或者 RLAB (13B) ,A33K 禾口 F68Y OgLuc变体在T = 0以RLU表示的平均发光(“平均值”)以及与WT OgLuc相比的变异系数(“％ cv”)。图14A-B概述了从在图13A-B中示出的分别使用0.5% tergitol测定缓冲液 (14A)或者RLAB(HB)的测定的数据确定的与WT OgLuc相比，A3!3K和F68Y OgLuc变体在 T = 0的发光增加倍数。图15A-B示出A3!3K和F68Y OgLuc变体与WT OgLuc相比的信号稳定性，使用0. 5% tergitol测定缓冲液。15A)A3!3K和F68Y OgLuc变体的光输出时程，在若干分钟内随时间测量以RLU表示的发光。15B)从在图15A中示出的光输出时程数据确定的A3I和F68Y OgLuc变体的以分钟表示的信号半衰期。图16A-B示出使用RLAB，A3;3K和F68Y OgLuc变体与WT OgLuc相比的信号稳定性。 16A)A33K和F68Y OgLuc变体的光输出时程，在若干分钟内随时间测量以RLU表示的发光。 16B)从在图16A中示出的光输出时程数据确定的A3I和F68Y OgLuc变体的以分钟表示的信号半衰期。图17示出A3I和F68Y OgLuc变体在22°C的蛋白质稳定性，以半衰期(分钟)表7J\ ο6图18A-B示出与m66R OgLuc变体和Renilla萤光素酶相比，核心组合OgLuc变体的光输出时程(即信号稳定性)，使用0. 5% tergitol测定缓冲液，在若干分钟内随时间测量以RLU表示的发光。图19示出使用RLAB，与m66R OgLuc变体和Renilla萤光素酶相比，核心组合 OgLuc变体的光输出时程(即信号稳定性)，在若干分钟内随时间测量以RLU表示的发光。图 20A-B 示出与 WT OgLu本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·P·昂塞尔，K·V·伍德，M·G·伍德，M·哈尔，P·奥托，G·维杜吉里斯，K·齐默尔曼，
申请(专利权)人：普罗梅加公司，
类型：发明
国别省市：