用于β-淀粉样肽的改进检测的方法和试剂技术

本发明专利技术涉及诊断神经退行性疾病，检测神经退行性疾病之前的阶段或基于β-淀粉样肽的特定池的水平以及特定的计算参数区分神经退行性疾病与神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述β-淀粉样肽的特定池与血浆成分结合或与血细胞结合，所述特定的计算参数通过一个或多个的淀粉样肽水平的算术组合获得。本发明专利技术还涉及用于实施上述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及免疫测定领域，并且更具体地，涉及用于增加测定生物流体中的 β-淀粉样肽的免疫测定的灵敏度的方法。
技术介绍
阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统的进行性·退行性疾病，其特征是进行性的和不断增加的记忆丧失，紧接着是丧失对肢体和身体功能的控制并最终死亡。其是痴呆症最常见的病因，影响1-6%的65岁以上人群和10-20%的80岁以上人群。AD与其他类型痴呆症的区别在于几个病理学特征，包括患者大脑中在神经元之间的细胞外隙中进行性地出现老年斑。该斑块具有淀粉样蛋白沉积物的中心核，其主要由被变性神经炎和胶质细胞包绕的称为淀粉样β肽(Αβ)的40-42个氨基酸肽的原纤维形成。 此肽由称为β淀粉样蛋白前体蛋白(βΑΡΡ)的前体蛋白的蛋白水解而成。AD可以根据出现的年龄分为早发型(60岁以下的年龄)和迟发型(60岁以上的年龄)，根据常染色体显性遗传的存在分为家族性AD或散发性AD。AD的早发家族形式可能与βΑΡΡ编码基因早老素I和早老素2(分别位于染色体21、14和I上)的已知突变有关。 这些分类不相互排斥。最常见的形式是散发性迟发形式。在临床惯例中，使用基于典型临床标志的存在的临床标准并使用神经影像技术和血液分析排除其他类型痴呆症进行AD的诊断。使用这些标准，诊断的可靠性是可接受的， 但是根据使用脑组织活检完成的研究，10-20%的被诊断有AD的患者患有不同的疾病。而且，目前的诊断方法仅可以在神经变性过程进展到患者患有严重的痴呆症并且大脑损害广泛到治疗措施数目有限的地步时才可进行。明确诊断需要尸检脑组织的病理学检查。鉴于Αβ在AD患者的大脑中积累并且是AD发病机制的中心要素的事实，此蛋白已经被认为是作为AD生物标志物的最合适候选物。然而，Αβ作为AD的血浆生物标志物的使用面临着这样的问题，即Αβ肽(Αβ (1-40)和Αβ (1-42))在血清中的浓度极低，使得没有足够灵敏以便允许可靠检测所述肽物种的测定方法。已经使用不同的测量来测定生物样品中的β_淀粉样肽水平(参见，例如，由 Scheuner 等(Nature Med. ,1996,2 :864-870) ；Tamaoka A 等(J Neurol Sci. ,1996,141， 65-68) ；Suzuki, N.等(Science，1994，264 :1336-1340) ；W0200722015, Vanderstichele H 等(Amyloid,2000,7,245-258) ；Fukomoto y col. (Arch. Neurol. 2003,60,958-964)； Mehta et al. (Arch. Neurol. 57,2000,100-105) ；Mayeux, R.等(Ann Neurol. 1999,46, 412-416) ；Lanz, T. A 和 Schacthter, J. B. (J. Neuroscience Methods, 2006，157 :71-81), W0200750359, W00162801, W00315617, W00246237, W00413172 所述的方法。然而，目前已知的所有基于ELISA的测定具有较小的检测限，其最大也达不到单位数的pg/mL的范围，其适于检测CSF中的A β 40和A β 42以及检测患有家族性AD的患者血浆中的所述物种，但不适合于检测患有散发性AD的患者血浆中的A β 42，在散发性AD中A β 42血浆浓度低得多。至今，显示检测限低于单位数pg/mL的唯一的A β肽测定对应于W0200646644中和TO2009015696中所述的测定。W0200646644描述了一种电致化学发光(ECL)夹心测定，其中mAb 21F12(识别 Αβ42的氨基酸33-42)与磁珠偶联，然后磁珠用来捕获含有A β 42的样品中的A β 42肽并进一步和与钌复合物偶联的3D6mAb接触。然后当施加电能时通过由钌复合物发射的光检测结合的3D6抗体的量。使用此测定，该专利技术人能够检测低至O. 5pg/mL的Αβ 42标准品。 然而，当使用同一测定来比较来自AD患者和健康对照的血浆样品中的A β 42时，在两组患者之间没有观察到显著的差异，这使得该专利技术人得出结论血清中完整Αβ 42的量由于降解而非常低，并且转为使用21F12mAb的竞争性ELISA测定，该测定提供ng/mL范围内的较低灵敏度水平。W02009015696描述了一种高灵敏度ELISA夹心测定，其中检测抗体与生物素标记的显示对所述抗体有特异性的试剂接触。该试剂和与过氧化物酶偶联的链霉亲和素接触。 然后通过使用TMB的比色法检测或使用QuantaBlue荧光检测过氧化物酶活性。W02006053251描述了一种测定样品中的β -淀粉样肽物种的方法，该方法包括使样品与变性剂接触，从样品-变性剂混合物中提取肽混合物，将β -淀粉样肽从该混合物中分离，并测定β_淀粉样肽物种的量。该方法在测定前需要分离肽的步骤，这导致增加的处理时间和增加的成本。 因此，在本领域中存在着对用于检测Αβ -衍生肽的改进的免疫学测定和试剂盒的需求，所述免疫学测定和试剂盒克服本领域中已知的方法和试剂盒的问题，具体地，它们足够灵敏从而以可靠的方式检测患有散发性AD的患者的血浆中的Αβ肽。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术涉及一种诊断受试者中的神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述方法包括以下步骤⑴确定选自由下列各项组成的组的一种或多种参数(a)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的淀粉样肽的水平，(b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述 一种或多种β -淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β_淀粉样肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种β-淀粉样肽的量来确定，(C)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种淀粉样肽的水平， 其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定；(ii)将参数(b)或(C)中的至少一个的值或由参数(a)至(C)中的至少两个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或(C)或所述计算参数的值的参比值进行比较；以及(iii)当相对于所述参比值所述参数的值或所述计算参数的值存在改变时,诊断所述神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。在第二个方面，本专利技术涉及一种用于测定生物样品中的β_淀粉样肽的试剂盒， 其包含(i)蛋白增溶剂，和(ii)至少一种针对β -淀粉样肽的抗体。附图说明图I A-F.对在两个外部实验室(Labl和Lab2)获得的(A)UP Αβ 1-40, (B) DPAβ 1-40，(C)CBAβ I-40，(D)UP Αβ I-42，(E)DP Αβ 1-42 和(F)CB Αβ 1-42 的测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.11 EP 09382279.91.诊断受试者中的神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述方法包括以下步骤 (i)确定选自以下的一种或多种参数 (a)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的￠-淀粉样肽的水平， (b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述一种或多种3 -淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述￠-淀粉样肽与所述生物样品中存在的成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种￠-淀粉样肽的量来确定， (C)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种￠-淀粉样肽的水平，其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述P-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定；以及 (ii)将参数(b)或(c)中的至少一个的值或由参数(a)至(c)中的至少两个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或(C)或所述计算参数的值的参比值进行比较；以及 (iii)当所述参数的值或所述计算参数的值相对于所述参比值存在改变时，诊断所述神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。2.权利要求I所述的方法，其中在步骤(i)中确定的参数是选自下列的一个或多个参数 (a)lab40，对应于所述受试者的生物样品中游离ABETA40肽的水平， (b)lab42，对应于所述受试者的生物样品中游离ABETA42肽的水平， (c)2ab40，对应于所述受试者的生物样品中游离ABETA40肽和与所述生物样品的成分缔合的ABETA40肽的合计水平，其中通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进ABETA40肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品中的ABETA40肽的量来确定2ab40， (d)2ab42，对应于所述受试者的生物样品中的游离ABETA42肽和与所述生物样品的成分缔合的ABETA42肽的合计水平，其中通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进ABETA42肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品中的ABETA42肽的量来确定2ab42， (e)3ab40,对应于与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的ABETA40肽的水平，其中通过在将所述生物样品的细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进￠-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触后定量ABETA40肽的量来确定3ab40，和 (f)3ab42，对应于与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的ABETA42肽的水平，其中通过在将所述生物样品的细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进￠-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触后定量ABETA42肽的量来确定3ab42。3.权利要求2所述的方法，其中步骤(ii)中获得的所述计算参数选自下组2ab40/2ab42、3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、lab40+2ab40、lab40+3ab40、2ab40+3ab40、lab40+2ab40+3ab40、lab42+2ab42、lab42+3ab42、2ab42+3ab42、Iab42+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+lab42+2ab42、lab40+3ab40+lab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42Uab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42, (Iab40+2ab40) /(Iab42+2ab42)、(Iab40+3ab40)/(Iab42+3ab42)、(2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、(Iab40 + 2ab403ab40)/ (Iab42+2ab42 + 3ab42)、(Iab42 + 2ab42)/ (Iab40+2ab40)、(Iab42+3ab42)/(Iab40+3ab40)、 (2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、 (Iab42+2ab42+3ab42)/(Iab40+2ab40+3ab40)、2ab40-lab40、2ab42_lab42 和(2ab40_lab40)/(2ab42_lab42)。4.权利要求2或3所述的方法，其中 (i)通过比较选自由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或选自由2ab40+3ab40、Iab42+2ab42+3ab42和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42组成的组的计算参数的值进行对神经退行性疾病的诊断， (ii)通过比较选自由2ab40、3ab40、lab42和2ab42组成的组的参数的值或选自由 2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42、Iab40+2ab40+3ab40、Iab42+2ab42+3ab42、Iab40+lab42+2ab42+3ab42、Iab40+2ab40+lab42+2ab42 和 Iab40+3ab40+lab42+3ab42 组成的组的计算参数的值进行对神经退行性疾病之前的阶段的检测，或 (iii)通过比较由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或通过比较由2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42 和 Iab40+2ab40+lab42+2ab42 组成的组的计算参数的值区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。5.权利要求4所述的方法，其中步骤(ii)中用来比较所述参数的值或所述计算参数的值的所述参比值选自以下 (i)当所述参数2ab40用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为63.8pg/ml, (ii)当所述参数3ab40用于诊断神经退行性疾病时为71.9pg/ml, (iii)当所述参数3ab40用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为71.lpg/ml, (iv)当所述参数3ab40用于区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段时为 211....

【专利技术属性】
技术研发人员：J·曼纽尔·萨拉萨巴里欧，
申请(专利权)人：艾拉科隆生物技术公司，
类型：发明
国别省市：