【技术实现步骤摘要】
一种新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法
[0001]本专利技术涉及生物制药
,具体是涉及一种新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法。
技术介绍
[0002]癌症是对人类健康最具威胁的重大疾病之一,其中肺癌是世界上引起死亡最多的癌症之一,发病率和死亡率常均居恶性肿瘤前列。非小细胞肺癌在所有肺癌中占比约85%,且大多数患者确诊时多处于晚期阶段。目前,化疗是临床上最常用的肺癌治疗方法之一。然而,化疗药物常具有缺乏肿瘤靶向性,药物利用率低,副作用大,易引起肿瘤耐药等问题,导致临床疗效欠佳。
[0003]抗菌肽是天然来源的药物,越来越多研究表明许多AMP具有较强的体内外抗肿瘤活性。相比传统化疗药而言,抗菌肽在抗肿瘤方面的优势显著。抗菌肽是一类由10
‑
100个氨基酸组成的短肽类,具有正电性及两亲性。目前,已发现抗菌肽数据库(APD)中超过250 条抗菌肽均具有抗肿瘤作用。抗菌肽的抗肿瘤作用机制可分为两大类:一是选择性膜破坏机制,与其杀菌作用类似,抗菌肽通过静电吸引直接与肿瘤细胞接触,形成穿膜孔洞或破坏直接细胞膜的完整性,使肿瘤细胞死亡;另一类为非膜破坏机制,包括有:破坏肿瘤细胞骨架使其结构紊乱,抑制肿瘤DNA合成,抑制肿瘤血管生成,调节免疫,诱导肿瘤细胞凋亡或坏死等,近年来,阳离子抗菌肽逐渐被证实能通过特异性的破膜作用机制发挥强抗肿瘤作用,这使其成为了最具研究前景的新型抗肿瘤药物之一。此外,许多研究发现阳离子抗菌肽可以通过破坏肿瘤细 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
dehydrogenase,LDH)释放率计算公式如下:LDH释放率(%)=(OD
实验组
‑
OD
对照组
)/(OD
阳性组
‑
OD
对照组
)
×
100
ꢀꢀꢀ
(公式2)步骤四:激光共聚焦显微镜观察Dermaseptin
‑
PP对H157细胞膜的影响;步骤五:Dermaseptin
‑
PP肽对H157细胞凋亡的影响,Dermaseptin
‑
PP肽对H157细胞凋亡的影响包括细胞接种及给药以及式细胞仪检测H157细胞凋亡率两个程序;步骤六:统计学分析,每个实验均重复三次,以GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析,数据以平均值(Mean)
±
标准差(SD)表示,组间两两比较采用t检验(two
‑
tailed Student
’
s tests),多组间差异比较采用ANOVA方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义;步骤七:得出研究结果,研究结果包括Dermaseptin
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PP的体外抗肿瘤活性、LDH释放评价Dermaseptin
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PP对H157细胞膜完整性影响、激光共聚焦显微镜观察Dermaseptin
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PP对H157细胞膜破坏作用以及Dermaseptin
‑
PP诱导H157细胞凋亡。3.根据权利要求2所述的新型抗菌肽Dermaseptin
‑
PP的研究方法,其特征在于,所述激光共聚焦显微镜观察Dermaseptin
‑
PP对H157细胞膜的影响包括:酶标仪检测,将处于对数生长期的H157肿瘤细胞用0.25%胰蛋白酶
‑
0.02%EDTA消化液消化下来,用培养基混悬得单细胞悬液后,利用血球计数板对细胞进行计数,按照细胞密度1
×
105个/mL,将细胞接种于共聚焦培养皿中,每皿2mL,置于5%CO2,37℃细胞培养箱中过夜培养至细胞单层覆盖率80%;分组及给药,同浓度Dermaseptin
‑
PP(浓度范围为10
‑9‑
10
‑4M)处理H157细胞24h以及高浓度Dermaseptin
‑
PP(浓度为10
‑4M)处理H157细胞不同时间(30min,1h,2h,4h,8h,16h和24h)后对H157细胞膜的破坏情况,实验分为Dermaseptin
‑
PP给药组和空白组,将细胞从培养箱中取出,弃去原培养基,空白组加入1mL新鲜培养基,其他皿细胞加入1mL含不同浓度Dermaseptin
‑
PP的培养基(浓度范围为10
‑9‑
10
‑4M),继续于培养箱中孵育一定时间;染色,对细胞膜和细胞核进行染色后,利用激光共聚焦成像系统观察给药后的H157细胞形态,直观的观察Dermaseptin
‑
PP肽对肿瘤细胞细胞膜的影响,取出给药结束的共聚焦培养皿,弃去含药培养基,PBS
×
1mL冲洗2次,加入100μL DIL染液(1︰50稀释),37℃孵育20min,弃去DIL染液,PBS
×
1mL冲洗2次,加入4%多聚甲醛500μL,4℃固定20min。PBS
×
1mL冲洗2次,加入100μL DAPI工作液(1︰100稀释),室温染色10min,PBS
×
1mL冲洗2次,将细胞保存在1mL Hanks平衡盐溶液(Hanks balanced salt solution,HBSS)中,使用激光共聚焦显微镜观察染色后细胞膜与细胞核,进行拍照记录,DIL染色液可将细胞膜染成红色,DAPI染色液可将细胞核染成蓝色。4.根据权利要求1所述的新型抗菌肽Dermaseptin
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PP的研究方法,其特征在于,所述Dermaseptin
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PP和化疗药物协同抗肺癌活性及其细胞膜活性机制研究包括如下步骤:步骤一:溶血实验;步骤二:荷H157肺癌皮下瘤裸鼠模型的建立;步骤三:Dermaseptin
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PP肽抗肺癌体内药效评价;步骤四:细胞凋亡通路分析及生物安全性评价;以及步骤五:得出研究结果。5.根据权利要求4所述的新型抗菌肽Dermaseptin
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PP的研究方法,其特征在于,所述溶血实验包括:
红细胞的制备,家兔腹主动脉取血于肝素抗...
【专利技术属性】
技术研发人员:陆洋,杜守颖,董姊怡,郭明雪,
申请(专利权)人:北京中医药大学,
类型:发明
国别省市:
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