利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，其包括：在倒置激光共聚焦显微镜的激光共聚焦小皿中放置具有中空结构的支撑架，再将载有活细胞的片状载体材料倒扣于支撑架上，并使片状载体材料上的活细胞位于支撑架的中空结构处，以保持片状载体材料的部分待观察面处于自然悬空状态；再采用倒置激光共聚焦显微镜的物镜对处于自然悬空状态的待观察面的活细胞进行观察。通过这种方法，能够避免在观察过程中对活细胞产生压力，并给对细胞进行加药刺激，适时观察药物对细胞的作用，从而扩展倒置激光共聚焦显微镜的适用范围，提高利用率。提高利用率。提高利用率。

【技术实现步骤摘要】
利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法


[0001]本专利技术属于细胞观测
，具体涉及一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法。

技术介绍

[0002]激光共聚焦显微镜是一种非常常见的实验仪器设备，它是在传统荧光显微镜成像的基础上采用激光作为光源，通过使用激光扫描装置和共轭聚焦装置，利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理的现代化光学显微镜。它能以极高的分辨率采集细胞或组织内部的荧光标记图像、观察细胞或组织内部的微细结构和形态学变化、在亚细胞水平观察胞内重要离子浓度或pH的变化、结合电生理技术观察和记录细胞的生理活动。使用激光扫描共聚焦显微镜，还可以对观察样品进行断层扫描成像、重构和分析细胞的三维空间结构。
[0003]根据结构的不同，激光共聚焦显微镜又可分为正置激光共聚焦显微镜及倒置激光共聚焦显微镜，其中倒置的激光共聚焦显微镜在医学研究领域使用范围更为广范，可进行固定的组织或细胞内亚细胞结构的观察或者养在培养皿底的活细胞的观察；可满足10X、20X、40X、60X、100X不同倍数的物镜或者油镜下观察的需求。而正置的激光共聚焦显微镜具有水镜，可在养有细胞的材料面正置的情况下，镜头伸入培养基内进行活细胞观察，但是水镜的观察倍数仅局限于40X及60X倍。由于倒置激光共聚焦显微镜和正置激光共聚焦显微镜价格昂贵，每台的售价约400万元。因此，由于经费限制，在医学院的研究设施配备中，两种激光共聚焦显微镜都配置的概率非常小。而由于倒置激光共聚焦显微镜的用途较为广泛，倒置激光共聚焦显微镜的配备则更常见，正置激光共聚焦显微镜配备相对较少。
[0004]然而，现有的在倒置激光共聚焦下进行材料表面活细胞观察的技术是直接将种有细胞的材料直接倒扣在激光共聚焦小皿里，这样会对细胞产生一个压力，其可能会对实验结果造成影响。进一步地，如果还需在观察的过程中对细胞进行加药刺激，则会面临“由于细胞与皿底之间的间隙太小，药物无法进入此间隙，最终导致药物无法作用于细胞”的窘境。当然，如果采用正置的激光共聚焦显微镜，可在一定程度上缓解这一境况，但由于激光共聚焦显微镜价格昂贵，两种激光共聚焦显微镜都配置的概率较小。基于这种现状，如何扩展倒置激光共聚焦显微镜的适用范围，利用其进行材料表面活细胞的实时观察并加药刺激，变得格外迫切。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，以避免在观察过程中对活细胞产生压力，并给对细胞进行加药刺激，适时观察药物对细胞的作用，从而扩展倒置激光共聚焦显微镜的适用范围，提高利用率。
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术提供一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实
验方法，其包括：
[0008]在倒置激光共聚焦显微镜的激光共聚焦小皿中放置具有中空结构的支撑架，再将载有活细胞的片状载体材料倒扣于支撑架上，并使片状载体材料上的活细胞位于支撑架的中空结构处，以保持片状载体材料的部分待观察面处于自然悬空状态；
[0009]再采用倒置激光共聚焦显微镜的物镜对处于自然悬空状态的待观察面的活细胞进行观察。
[0010]本专利技术提供的这种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，首先在倒置放置的种有活细胞的片状载体材料与激光共聚焦小皿的皿底之间放置一个支撑架，使片状载体材料上的活细胞位于支撑架的中空结构处，以保持片状载体材料的部分待观察面处于自然悬空状态，从而避免待观察面的细胞受到压力而影响实验结果，从而解决了现有技术存在的问题。同时，使用支撑架后，可使片状载体材料与激光共聚焦小皿的皿底之间产生间隙，从而使向激光共聚焦小皿内加入的药物可以作用于片状载体材料表面接种的细胞，从而解决现有技术中药物难以作用于载体材料表面细胞的问题。
[0011]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述支撑架的形状为十字形、圆环形或者人字形。
[0012]优选地，上述支撑架的形状为十字架。这种支撑架对载体材料表面的遮挡较小，从而不会过多的遮挡载体材料表面的活细胞，而且由于其将载体材料分成了四个象限，有四个开口，有利于药物从四个开口加入，从而有效刺激细胞。
[0013]优选地，在本专利技术较佳的实施例中，上述支撑架的材质为纯金属。
[0014]优选地，在本专利技术较佳的实施例中，上述支撑架为纯钛金属十字架。这种十字架有着不易变形且已消毒、可反复使用的优点，十分环保，且钛金属生物安全性好，对细胞无毒副作用。
[0015]优选地，在本专利技术较佳的实施例中，上述支撑架的厚度为0.3～0.8mm。
[0016]优选地，在本专利技术较佳的实施例中，上述支撑架的的厚度为0.45mm或者0.65mm。
[0017]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述物镜为倍数为20倍或者40倍。
[0018]优选地，在本专利技术较佳的实施例中，上述支撑架为厚度为0.45mm的纯钛金属十字架，物镜为40倍激光共聚焦显微镜；
[0019]或者，支撑架为厚度为0.65mm的纯钛金属十字架，物镜为20倍激光共聚焦显微镜。
[0020]优选地，在本专利技术较佳的实施例中，上述激光共聚焦小皿的型号为0号。
[0021]虽然使用支撑架将载体材料垫起来，满足了药物有效作用于活细胞的空间，但是为了在40倍及20倍物镜下对焦，首先所使用的激光共聚焦小皿为“0号”，其底是最薄的，其次若在40倍下对焦，且要满足药物作用于细胞有足够的空间，纯钛十字架的厚度应为0.45mm，若在20倍下对焦，且要满足药物作用于细胞有足够的空间，纯钛十字架的厚度可为0.65mm。
[0022]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述片状载体材料为圆形纯钛金属片。优选地，在本专利技术较佳的实施例中，上述圆形纯钛金属片的表面形貌为5V纳米管，直径为10mm，厚为1mm。
[0023]这种纳米管的制备是通过阳极氧化的方式在5V电压下制备的，后续在其钛纳米管表面接种细胞。当然也可选用其他材质或者其他形貌的材料，不限于纯钛金属圆片及纳米
管形貌。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实验例中的圆形纯钛金属片的示意图；
[0025]图2为本专利技术实验例中的纯钛十字架的示意图；
[0026]图3为本专利技术实验例中的“0”号激光共聚焦小皿的示意图；
[0027]图4为本专利技术实验例中的将纯钛十字架放入“0”号激光共聚焦小皿的示意图；
[0028]图5为本专利技术实验例中的将圆形纯钛金属片倒扣在纯钛十字架上的示意图；
[0029]图6为本专利技术实验例中的实验组在0.65mm钛支架+20倍物镜下对焦的图片；
[0030]图7为本专利技术实验例中的对照组在0.65mm钛支架+20倍物镜下对焦的图片；
[0031]图8为本专利技术实验例中的实验组在0.45mm钛支架+40倍物镜下对焦的图片；
[0032]图9为本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，其特征在于，其包括：在倒置激光共聚焦显微镜的激光共聚焦小皿中放置具有中空结构的支撑架，再将载有活细胞的片状载体材料倒扣于所述支撑架上，并使所述片状载体材料上的活细胞位于所述支撑架的中空结构处，以保持所述片状载体材料的部分待观察面处于自然悬空状态；再采用倒置激光共聚焦显微镜的物镜对处于自然悬空状态的所述待观察面的活细胞进行观察。2.根据权利要求1所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，其特征在于，所述支撑架的形状为十字形、圆环形或者人字形。3.根据权利要求2所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，其特征在于，所述支撑架为纯钛金属十字架。4.根据权利要求3所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，其特征在于，所述支撑架的厚度为0.3～0.8mm。5.根据权利要求4所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张燕，张玉梅，李恺，宋文，何奕德，冀吉昀，李毅，余佳，艾林，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：