一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备，包括以下步骤：毒素体外活性验证：采用Bradford试剂盒检测纯化后LT蛋白浓度，并用完全培养基将其稀释到100μg

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备


[0001]本专利技术涉及中兽医
领域，具体涉及一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测以及多克隆抗体的制备。

技术介绍

[0002]经过纯化过程后的蛋白，蛋白活性、免疫原性以及稳定性都需要进行检测，因为在体外提取纯化蛋白的过程中，经历了各种条件的的变化，蛋白的生物活性与蛋白的三维结构、基团修饰以及所处的环境等密切相关，任何条件的改变都可能会影响到蛋白的生物活性。随着科学技术的发展，无论通过哪种途径获取目标蛋白，都可能导致蛋白失去原有的空间构象、基团修饰等，从而导致蛋白活性发生改变，这样就需要我们在体外对蛋白的活性做出新的判定。通过适合的方法对动物给药，或者刺激细胞观察形态学变化等都是检测蛋白活性的简便方法。

技术实现思路

[0003]针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术提取的LT蛋白活性良好，冻干后 4℃保存稳定性最优；多次免疫后制备出多克隆抗体这不仅体现了LT具有良好的免疫原性，还可以为后续检测提供帮助。
[0004]为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案来实现：
[0005]一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测，其特征在于，包括以下步骤：
[0006](1)毒素体外活性验证：采用Bradford试剂盒检测纯化后LT蛋白浓度，并用完全培养基将其稀释到100μg
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mL
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1，10μg
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mL
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1，1μg
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mL
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1，0.1μg
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mL
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1， 0.01μg
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mL
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1。复苏Vero细胞进行传代培养，将消化下来的细胞计数并接种于24 孔板中，37℃、5％CO2培养。细胞贴壁后设置LT蛋白处理组和空白对照组每组三个重复；培养3h后拍照观察细胞形态变化；
[0007](2)毒素体内活性验证：本试验采用腹腔注射的方法；试验分两组，每组5 只小鼠：试验组(腹腔注射LT0.2mg
·
只)和对照组(腹腔注射等量PBS缓冲液)；试验开始后禁食不禁水，腹腔注射毒素后观察记录试验组症状，6h后称重，剖检时从幽门至肛门处取其肠段并称重；
[0008](3)将纯化得到的蛋白进行浓度测定后取出等量4份每份1mL进行处理，处理完后测定每份浓度。
[0009]优选地，第一份直接保存于4℃，第二份直接保存于
‑
80℃，第三份冻干后保存于4℃，第四份冻干后保存于
‑
80℃。
[0010]优选地，将LT蛋白稀释到所需浓度后与弗氏佐剂等体积充分混合乳化，对 5只小鼠进行免疫，免疫后一周以及试验结束时分别对小鼠进行预采血，用毛细管眼眶采血0.2mL左右置于37℃30min后将凝结好的血液在3000r
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min
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1离心 15min收集上清用来检测抗体
效价；血清抗体效价检测采用ELISA的方法，具体步骤如下：
[0011](1)于96孔板中每孔滴加100uL，2ug
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mL
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1抗原，于4℃过夜；
[0012](2)弃掉抗原，每孔加入200uL的封闭液，37℃孵育2h；
[0013](3)弃掉封闭液，洗涤液洗板3次，弃干净残留液体；
[0014](4)在第一孔加入阴性对照100uL，第二孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时；
[0015](5)参照(3)洗板后，每孔加入100uL的HRP标记的兔抗小鼠二抗稀释液(1：10000稀释)，于37℃孵育1小时；
[0016](6)弃掉液体，洗板3次拍干，每孔加入100uL的TMB，37℃孵育15min(根据颜色深浅来决定显色的时间)；
[0017](7)每孔加入50uL的终止液(2NH2SO4)，在酶标仪上读取波长450nm 处的吸光度值。
[0018]优选地，待进行免疫小鼠抗体效价检测完后对效价高小鼠进行眼球摘除采血，离心分离血清；抗血清用PBS等体积稀释，10000r
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min
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1离心15min，取上清；纯化首先将抗体纯化预装柱取出后用10mL结合缓冲液平衡，然后将稀释离心后的血清加入到平衡好的柱子中；过完柱子用10倍体积的PBS清洗抗体纯化柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白；然后用5mL抗体洗脱液洗涤柱子，并收集以得到特异性抗体；洗脱结束后用50mLPBS平衡柱，最后用20％的酒精封存柱子，4℃保存。在得到洗脱的抗体后，使用紫外可见分光光度计在波长280nm 处测定抗体浓。
[0019]优选地，还包括对抗体灵敏度的检测；
[0020]将10ugLT蛋白进行连续10倍稀释后与5X上样缓冲液混合，100℃煮5min。然后参照2.2.5进行电泳，电泳结束后进行下列步骤：
[0021](1)转膜。根据Marker条带裁胶，准备一张大小合适的PVDF膜，甲醇活化30s后按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序放入海绵垫夹层中，赶尽气泡。转膜在4℃条件下进行，200mA1.5h。
[0022](2)封闭。将PVDF膜浸泡于5％脱脂奶粉中，室温摇床1h。
[0023](3)孵育一抗。用5％脱脂奶粉按1:1000稀释一抗，4℃过夜孵育。TBST 洗涤3次，每次10min。
[0024](4)孵育二抗。羊抗小鼠
‑
HRP二抗1：2000脱脂奶粉稀释，室温轻摇60min。 TBST洗涤3次，每次15min。
[0025](5)ECL显影。
[0026]由于采用以上技术方案，本专利技术的有益效果包括：
[0027]本专利技术提取的LT蛋白活性良好，冻干后4℃保存稳定性最优；多次免疫后制备出多克隆抗体这不仅体现了LT具有良好的免疫原性，还可以为后续检测提供帮助。
附图说明
[0028]图1不同浓度LT作用Vero细胞6h图片(10x)；
[0029]图2小鼠肠重与体重比值分析(n＝3)。
具体实施方式
[0030]下面结合实施例作进一步说明，但本专利技术不局限于这些实施例。
[0031]一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测，包括以下步骤：
[0032](1)毒素体外活性验证：采用Bradford试剂盒检测纯化后LT蛋白浓度，并用完全培养基将其稀释到100μg
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1。复苏Vero细胞进行传代培养，将消化下来的细胞计数并接种于24 孔板中，37℃、5％CO2培养。细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测，其特征在于，包括以下步骤：(1)毒素体外活性验证：采用Bradford试剂盒检测纯化后LT蛋白浓度，并用完全培养基将其稀释到100μg
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1，10μg
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1，0.01μg
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1。复苏Vero细胞进行传代培养，将消化下来的细胞计数并接种于24孔板中，37℃、5％CO2培养。细胞贴壁后设置LT蛋白处理组和空白对照组每组三个重复；培养3h后拍照观察细胞形态变化；(2)毒素体内活性验证：本试验采用腹腔注射的方法；试验分两组，每组5只小鼠：试验组(腹腔注射LT 0.2mg
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只)和对照组(腹腔注射等量PBS缓冲液)；试验开始后禁食不禁水，腹腔注射毒素后观察记录试验组症状，6h后称重，剖检时从幽门至肛门处取其肠段并称重；(3)将纯化得到的蛋白进行浓度测定后取出等量4份每份1mL进行处理，处理完后测定每份浓度。2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌热敏肠毒素活性、稳定性检测，其特征在于，第一份直接保存于4℃，第二份直接保存于
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80℃，第三份冻干后保存于4℃，第四份冻干后保存于
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80℃。3.一种大肠杆菌热敏肠毒素多克隆抗体的制备，其特征在于，将LT蛋白稀释到所需浓度后与弗氏佐剂等体积充分混合乳化，对5只小鼠进行免疫，免疫后一周以及试验结束时分别对小鼠进行预采血，用毛细管眼眶采血0.2mL左右置于37℃30min后将凝结好的血液在3000r
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1离心15min收集上清用来检测抗体效价；血清抗体效价检测采用ELISA的方法，具体步骤如下：(1)于96孔板中每孔滴加100uL，2ug
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1抗原，于4℃过夜；(2)弃掉抗原，每孔加入200uL的封闭液，37℃孵...

【专利技术属性】
技术研发人员：张倩，马维超，施晓洁，鲁冠杰，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：